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紫花苜蓿(Medicago sativa L.)作为优质的豆科牧草,在畜牧养殖业发展中起着重要作用。在不同组织和不同处理环境下的目的基因表达是了解基因生物学功能的重要途径,而通过实时荧光定量PCR筛选出来的合适的内参基因是研究基因表达准确性的关键。WRKY作为植物最重要的转录因子之一,参与植物许多不同的生理和发育过程,在植物的生长发育和逆境反应中扮演着重要角色。因此,本论文对紫花苜蓿内参基因进行筛选和克隆MsWRKY33基因并进行生物学分析。本研究主要结论如下：1.从紫花苜蓿中克隆到常用的内参基因18S rRNA的基因cDNA全长,在此基础上结合UBC2、EF-1α、β-tubulin、β-actin、Actin2、MSC27、GAPDH7个内参基因,通过实时荧光定量PCR技术检测8个内参基因在不同组织和各种胁迫(激素、盐、干旱和暗)条件下的表达情况。通过geNorm软件筛选出相对稳定的内参基因并确定出最适内参基因数,得出紫花苜蓿在不同组织器官及不同胁迫处理情况下,MSC27、18S rRNA、 EF-1α、Actin2是相对比较稳定的内参基因。2.根据高通量筛选得到WRKY转录因子的Unigene序列,结合RT-PCR和RACE扩增技术,从紫花苜蓿叶片中克隆到一个WRKY基因,命名为MsWRKY33。该基因cDNA全长为1891bp,开放阅读框为1536bp,编码511个氨基酸。氨基酸序列比对表明,该基因编码的氨基酸与拟南芥和水稻等WRKY转录因子具有较高的同源性。MsWRKY33含有2个高度保守的氨基酸序列WRKYGQK和2个Cys2His2锌指结构,属于Ⅰ类。3.根据筛选出的紫花苜蓿稳定的18S rRNA为内参基因,实时荧光定量分析MsWRKY33基因在不同胁迫条件转录水平表达情况,结果表明：MsWRKY33受冷、PEG、 ABA诱导,都表现出增加的趋势；在盐胁迫下,4小时后MsRKY33表达量有降低的趋势；在重金属处理下,MsWRKY33在前12h出现短暂增加,但从12h后表达量下降。4.根据从紫花苜蓿得到的MsWRKY33基因,构建植物双元表达载体pCAMBIA3301-MsWRKY33,通过农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥。经过后代的筛选、扩繁和分子检测,得到超表达的转基因拟南芥株系。4℃冷处理条件下,转基因拟南芥根系比野生型根要长,推测MsWRKY33基因参与植株对冷害的抗性有关。