线粒体是真核细胞中含有核外遗传物质的一类细胞器,主要调节细胞的能量代谢,是真核细胞赖以生存的基础[1]。线粒体主要功能有(1)合成机体所需的大部分三磷酸腺苷(Adenosine-5?-triphosphate,ATP);(2)氧化并清除细胞内过多的脂肪酸,同时阻断非酯化脂肪酸进入循环血液;(3)钙稳态的维持,同时调节细胞凋亡与死亡途径[2]。线粒体进行生命活动过程中能够生成活性氧(reactive oxygen species,ROS),生理条件下,ROS很快被体内的抗氧化酶所清除,从而能够维持ROS生成与被清除的平衡,当线粒体ROS产生异常增多或抗氧化能力下降,氧化应激就会产生[3]。线粒体源性的氧化应激亦可以引起内皮细胞线粒体渗透性转变孔道的开放介导释放炎症因子,炎性反应的发生亦会破坏机体的稳态[4]。线粒体功能障碍导致的ATP合成减少、氧化应激以及炎症反应等因素相互协同,影响,作用于多种疾病的发生、发展。目前,业已证实线粒体功能障碍与神经退行性变,糖尿病,衰老等密切相关[5-7]。例如,在衰老早期机体尚未出现组织形态改变的时候,线粒体即出现功能减退[8]。线粒体功能障碍与肾脏病的关系亦引起业内人士的重视,肾组织内富含线粒体,氧化磷酸化系统受损将导致线粒体功能紊乱。2000年,Doleris LM等[9]报道了4例线粒体细胞病患者并发有局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis,FSGS),最终进展为终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)。另有研究报道[10]线粒体DNA(mt DNA)突变在FSGS患者肾组织中蓄积达到80%,而嘌呤霉素核苷(Puromycin nucleoside,PAN)动物模型的肾小球中,线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A,TFAM)信使RNA(messenger RNA,m RNA)早期明显升高,晚期到了FSGS阶段则会明显下降。本课题组前期实验结果[11]亦提示抑制线粒体功能障碍能够减轻蛋白尿诱导的小鼠慢性肾病模型。这些报道均揭示线粒体功能障碍与肾脏疾病存在密切关系。慢性肾功能衰竭(chronic renal failure,CRF)是各类肾脏疾病终末期的共同表现,是以肾单位进行性损坏造成肾脏的排泄系统、代谢内分泌功能紊乱的一组临床症候群,预后欠佳[12]。目前,CRF的治疗主要为保护残余肾单位,因此,寻找有效可靠的治疗新靶点进行综合治疗有利于CRF的防控。线粒体发生功能障碍时ATP的合成量减少,氧自由基大量生成,炎症因子释放增多,这些因素大部分均伴随于CRF的发生、发展,并最终促使CRF向ESRD转化[13]。此外,肾小管间质纤维化是CRF发生、发展至ESRD期的共同通路,肾小管间质纤维化与CRF严重程度密切相关。因此,我们设想线粒体功能障碍参与了CRF的肾小管间质纤维化,阻断线粒体功能障碍能够减轻CRF肾小管间质纤维化及症状,并延缓CRF进展。过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferator activated receptor gamma,PPAR)属于由配体激活的核细胞受体家族,主要分三种亚型:α、β、γ,在肾脏中发挥主要作用的是PPARγ[14]。PPARγ主要参与了肾脏的发育以及脂质代谢,同时PPARγ能够调节水钠的重吸收、调节肾血流量并且激活肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin-system,RAAS)[15]。PPARγ具有调节抗氧化酶、抗氧化应激作用,PPARγ激动剂对肾脏有保护作用,同时亦能够缓解肾脏细胞的损伤[16]。激动PPARγ能够减轻肾小球系膜炎症反应和纤维化[17];PPARγ激动亦能够缓解单侧输尿管结扎(unilateral ureter obstruction,UUO)模型中的肾间质纤维化[18]。线粒体功能障碍是否参与了PPARγ激动对肾脏的保护作用值得进一步研究。本课题组前期实验结果提示PPARγ激动剂能够阻断线粒体功能障碍并缓解醛固酮诱导的足细胞损伤、系膜细胞增殖[19,20]。鉴于PPARγ的抗氧化功能,我们预想PPARγ激动剂能够通过阻断线粒体功能障碍减轻CRF肾小管间质纤维化以及症状。线粒体功能障碍一般都伴随有炎症反应的增加[21],而炎症反应在初始阶段通常被认为是机体的适应性反应,持续性炎症反应易造成机体的损伤。相对于特异性免疫反应(T、B细胞),天然免疫是机体抵抗病原微生物侵袭的第一道防线,在抗感染免疫中发挥重要作用。天然免疫可以通过胞膜和胞浆的模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)识别各种感染性及非感染性的刺激。核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族(nucleotide binding oligomerization domain,NOD)样受体家族包含pyrin结构域蛋白3(NOD-like receptor family,pyrin domain containing 3,NLRP3)是PRR大家族中NOD成员之一,在活化后可以招募凋亡相关斑点样蛋白(Apoptosis-associated Speck-like Protein containing CARD,ASC)及半胱天冬酶-1前体(pro-caspase-1)形成一个大分子蛋白复合物“NLRP3炎症小体”(NLRP3,ASC,pro-caspase-1),其使半胱天冬酶-1(caspase-1)活化,进而裂解IL-1β前体(pro-Interleukin-1β,pro-IL-1β)和IL-18前体(pro-Interleukin-18,pro-IL-18)[22],最终导致IL-1β和IL-18等促炎因子的产生与分泌,参与机体的炎症反应。线粒体功能障碍与CRF通常都伴随有持续加重的炎症反应,NLRP3炎症小体的活化导致的IL-1β和IL-18的大量释放已经被证实与肾脏疾病相关,本课题组前期实验结果亦提示NLRP3炎症小体基因敲除能够抑制线粒体功能障碍并缓解白蛋白所诱导的肾小管上皮细胞(proximal epithelial cell,PTC)损伤[23]。NLRP3炎症小体亦参与了UUO模型的发病、发展[24],而UUO模型典型的肾脏病理改变即是肾小管间质纤维化,肾纤维化几乎伴随着CRF的整个发展阶段。因此,我们设想下调NLRP3炎症小体能够通过阻断线粒体功能障碍从而减轻CRF肾小管间质纤维化及症状。深入认识和理解研究线粒体功能障碍在CRF肾小管间质纤维化发生、发展中的作用,为阐明肾脏疾病的发病机制及其临床防治提供了新的思路。同时我们对PPARγ与NLRP3炎症小体的进一步研究有利于更深入的理解其与线粒体功能障碍的关系以及为寻求CRF新的治疗靶点提供帮助。第一部分线粒体功能障碍在慢性肾功能衰竭肾小管间质纤维化中的作用目的:探讨线粒体功能障碍在CRF肾小管间质纤维化中的作用。方法:体外培养小鼠PTC,应用转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)刺激,抗氧化剂锰苯甲酸卟啉(Manganese(III)5,10,15,20-tetrakis(4-benzoic acid)porphyrin,Mn TBAP)预处理小鼠PTC,分为正常组、TGF-β1组、Mn TBAP+TGF-β1组。体内通过5/6肾切除术构建小鼠CRF模型,此外,应用Mn TBAP腹腔注射小鼠,随机分为4组:正常组、5/6肾切组、Mn TBAP组、Mn TBAP+5/6肾切组。应用real-time聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)和western blot法检测E-cadherin、Vimentin、α-平滑肌激动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、NLRP3、PPARγ的表达;应用电镜检测小鼠PTC内线粒体超微结构的变化;荧光探针DCHFDA染料结合流式细胞仪测定细胞内ROS水平;JC-1染色激光共聚焦并结合流式细胞术测定PTC线粒体膜电位;应用real-time PCR测定mt DNA的拷贝数;酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测尿蛋白/肌酐比值以及血尿素氮、肌酐、血红蛋白(hemoglobin,Hb);BP2000无创血压仪检测鼠尾动脉血压;脾脏称重;Masson染色;real-time PCR和western blot检测肾皮质Fibronectin、Collagen-I、Collagen-III的表达;结果:(1)TGF-β1呈时间依赖性抑制小鼠PTC E-cadherin的表达,促进Vimentin、α-SMA的表达;(2)TGF-β1呈浓度依赖性的促进小鼠PTC ROS产生,以时间依赖性的降低线粒体膜电位、mt DNA拷贝数。电镜观察正常组小鼠PTC线粒体形态规则饱满,线粒体嵴排列整齐清晰。TGF-β1呈时间依赖性诱导小鼠PTC线粒体形态肿胀加大,嵴模糊不清甚至消失。(3)5/6肾脏切除小鼠2周尿蛋白/肌酐比值开始显著增高,8周尾动脉血压明显增高,12周脾脏重量明显增加,Hb显著下降,血清尿素氮,肌酐显著增高,Masson染色提示小管间质纤维化明显,肾组织PTC线粒体形态肿胀,嵴模糊不清甚至消失。肾皮质mt DNA拷贝数显著下降,肾皮质NLRP3 m RNA显著增高,PPARγm RNA显著下降。(4)Mn TBAP抑制TGF-β1诱导的小鼠PTC ROS生成,逆转线粒体膜电位和mt DNA拷贝数下降,上调E-cadherin表达,抑制Vimentin、α-SMA表达。(5)Mn TBAP+5/6肾切组与5/6肾切组相比,肾小管间质纤维化显著好转,肾皮质Fibronectin、Collagen-I、Collagen-III蛋白表达和m RNA相对量明显减少,血清肌酐、尿素氮、脾脏重量、血压下降、尿蛋白/肌酐比值下降,Hb上升。此外,Mn TBAP+5/6肾切组较5/6肾切组,肾组织PTC线粒体超微结构改善;mt DNA拷贝数明显增多。结论:线粒体功能障碍参与了CRF肾小管间质纤维化及症状,阻断线粒体功能障碍能够减轻CRF肾小管间质纤维化及症状。第二部分PPARγ可减轻慢性肾功能衰竭线粒体功能障碍和肾小管间质纤维化目的:观察PPARγ对CRF线粒体功能障碍和肾小管间质纤维化的作用。方法:体外培养小鼠PTC,瞬时转染pc DNA3-h PPARγ质粒,分为四组:正常组、空载(Vehicle,Vehi)组、TGF-β1刺激组、PPARγ过表达+TGF-β1刺激组。体内实验通过5/6肾切除构建CRF小鼠模型,随机分为四组:正常组、5/6肾切除组、罗格列酮灌胃组、5/6肾切除+罗格列酮灌胃组。采用real-time PCR以及western blot方法检测E-cadherin、α-SMA、Vimentin的表达;电镜检测肾组织内PTC线粒体超微结构的变化;荧光探针DCHFDA染料法测定细胞内ROS水平;JC-1染色激光共聚焦并结合流式细胞术测定线粒体膜电位;应用real-time PCR法测定mt DNA的拷贝数;ELISA法检测尿蛋白/肌酐比值以及血尿素氮、肌酐、Hb;BP2000无创血压仪检测鼠尾动脉血压;脾脏称重;Masson染色;real-time PCR和western blot检测肾皮质Fibronectin、Collagen-I、Collagen-III的表达。结果:(1)PPARγ阻断TGF-β1诱导的小鼠PTC ROS生成,逆转线粒体膜电位和mt DNA拷贝数下降,改善线粒体超微结构、上调E-cadherin表达,抑制Vimentin、α-SMA表达。(2)5/6肾切+罗格列酮灌胃组与5/6肾切组相比,肾小管间质纤维化组显著好转,肾皮质Fibronectin、Collagen-I、Collagen-III蛋白表达和m RNA相对量明显减少,血清肌酐、尿素氮、脾脏重量、血压下降、尿蛋白/肌酐比值下降,Hb上升。此外,5/6肾切+罗格列酮灌胃组较5/6肾切组,肾组织PTC线粒体超微结构改善;mt DNA拷贝数明显增多。结论:PPARγ可以减轻CRF肾小管间质纤维化及症状,这可能与抑制线粒体功能障碍有关。第三部分下调NLRP3可减轻慢性肾功能衰竭线粒体功能障碍和肾小管间质纤维化目的:观察下调NLRP3对CRF线粒体功能障碍和肾小管间质纤维化的作用。方法:体外培养小鼠PTC,瞬时转染NLRP3小干扰RNA(small interfering RNA,Si RNA),分为四组:正常组、Vehi组、TGF-β1刺激组、NLRP3-/-+TGF-β1刺激组。体内实验通过5/6肾切除构建CRF小鼠模型,随机分为四组:正常组、5/6肾切除组、NLRP3-/-组、5/6肾切除+NLRP3-/-组。应用real-time PCR和western blot法检测E-cadherin、Vimentin、α-SMA的表达;电镜检测小鼠PTC内线粒体形态的改变;采用荧光探针DCHFDA染料检测细胞内ROS生成情况;JC-1染色激光共聚焦结合流式细胞术检测线粒体膜电位;real-time PCR检测mt DNA拷贝数。ELISA法检测尿蛋白/肌酐比值以及血尿素氮、肌酐、Hb;BP2000无创血压仪检测鼠尾动脉血压;脾脏称重;Masson染色;real-time PCR和western blot检测肾皮质Fibronectin、Collagen-I、Collagen-III的表达。结果:(1)下调NLRP3能阻断TGF-β1诱导的小鼠PTC ROS生成,逆转线粒体膜电位和mt DNA拷贝数下降,改善线粒体超微结构、上调E-cadherin表达,抑制Vimentin、α-SMA表达。(2)5/6肾切+NLRP3-/-组与5/6肾切组相比,肾小管间质纤维化组显著好转,肾皮质Fibronectin、Collagen-I、Collagen-III蛋白表达和m RNA相对量明显减少,血清肌酐、尿素氮、脾脏重量、血压下降、尿蛋白/肌酐比值下降,Hb上升。此外,5/6肾切+NLRP3-/-组较5/6肾切组,肾组织PTC线粒体超微结构改善;mt DNA拷贝数明显增多。结论:下调NLRP3能减轻CRF肾小管间质纤维化及症状,这可能与其抑制线粒体功能障碍有关。