【摘 要】
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脂肪酶是一种重要的工业用酶,在各个领域获得了广泛的应用。随着脂肪酶应用领域的扩大,开发新型高效的脂肪酶和提高脂肪酶的产量已成为酶制剂行业关注热点之一。为了满足这一需求,建立一个高效的获取脂肪酶基因并且验证其基因表达产物活性的技术流程是非常必须的。本论文中,我们建立了全基因合成方法流程及高效毕赤酵母表达载体,并通过解脂酵母YL2脂肪酶基因验证了该流程的高效性。本文的结果如下: （1）全基因合
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脂肪酶是一种重要的工业用酶,在各个领域获得了广泛的应用。随着脂肪酶应用领域的扩大,开发新型高效的脂肪酶和提高脂肪酶的产量已成为酶制剂行业关注热点之一。为了满足这一需求,建立一个高效的获取脂肪酶基因并且验证其基因表达产物活性的技术流程是非常必须的。本论文中,我们建立了全基因合成方法流程及高效毕赤酵母表达载体,并通过解脂酵母YL2脂肪酶基因验证了该流程的高效性。本文的结果如下: （1）全基因合成方法的建立。在已有的基因合成方法基础上,提出一种低成本,低错误率,重复性好的基因合成方法-IOEP（Improved overlap extension PCR）法。该方法拆分的单链寡核苷酸长度为60nt左右,重叠区碱基数13-17bp,Tm值为40-50℃。合成过程采用DA-PCR、OE-PCR两步法合成。对于合成基因测序后的突变,利用寡核苷酸覆盖法进行修复。研究中利用IOEP法合成了10条长度为731-1511bp的基因,其平均化学合成成本率为1.291,平均错误率为1.031‰,相比已有方法都有所改善。 （2）高效表达的毕赤酵母表达载体的构建。由于毕赤酵母表达系统可分泌表达可溶性蛋白,因而选取其作为表达系统。对毕赤酵母表达载体pPIC9K添加XcmI酶切位点等操作,改造为pAOX-HT-BSK质粒。该载体可以实现T/A克隆,可直接克隆PCR产物;N段设计有His标签,可通过亲和层析方法纯化重组蛋白。并通过AflII酶切连接产物,进一步提高基因的克隆效率。通过克隆calb基因来验证pAOX-HT载体的效率,结果发现,T/A克隆后的蓝斑率为2.6‰,正向连接阳性克隆的效率达到了80%以上,而且CALB在毕赤酵母表达系统中正确表达,目的蛋白可通过Ni柱快速纯化。 （3）耶氏酵母YL2脂肪酶基因人工合成、克隆及在毕赤酵母中表达。为了验证IOEP全基因合成及利用pAOX-HT载体克隆表达的效率,人工全基因合成了yl2基因,并在毕赤酵母中表达了YL2脂肪酶,通过过亲和层析获得了纯度为90%以上重组脂肪酶。
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