世界范围报道的坏死性小肠结肠炎(necrotising enterocolitis, NEC)在活产儿中发病率为1‰-3‰,极低出生体重的早产儿发病率为10%,且88%的病例发生于胎龄小于32周的极早产儿,是影响早产儿存活及远期预后的重要疾病,其发病机制仍未完全阐明。最近,越来越多的研究表明,多种细胞因子及其介导的信号途径在NEC患儿系统炎症反应中起重要作用。但这些研究多数关注促炎细胞因子,有关保护性的细胞因子方面的报道较少。研究证实,白细胞介素-11(interleukin-11, IL-11)在多种原因致肠损伤时,可发挥抗凋亡、促增殖、下调促炎因子、营养肠细胞等保护作用。本基金课题前期研究表明：早产儿外周血清IL-11(内源性)水平与胎龄呈正相关,且在NEC时反应性上调,参与了早产儿NEC病变过程。尽管机体在NEC时也有保护性的反应,但NEC时病情往往进展迅速,死亡风险极高,可能为不成熟的机体在应对刺激时,机体的促炎与抗炎等反面仍处于失衡状态,难以对抗病情的进展。因此,开展深入研究来尝试应用外源性保护因子来促进NEC病变恢复,将为阐明NEC分子机制及诊治、治疗提供新的思路。IL-11是1990年Paul等通过对灵长类骨髓的基质细胞系的研究中发现的多效能细胞因子。IL-11不仅对造血系统具有广泛的生物学活性,近年来还发现IL-11对非造血系统也有影响。尤其是通过参与细胞生理调控对多种原因造成的肠上皮损伤具有保护和促进恢复作用。已有研究表明,IL-11参与了早产NEC患儿的内源性细胞因子反应。Nadler等研究发现,IL-11mRNA在急性期NEC患儿肠组织中适应性上调,这种反应能减少NEC损伤的程度,提示IL-11mRNA表达与NEC的病变程度呈负相关。Dickinson等研究发现,在肠坏死范围较广的NEC患儿或肠造瘘术后患儿中,外源性应用IL-11可预防黏膜萎缩和肠缩短,因此有助于减少重症NEC患儿短肠综合征发生。这些研究提示IL-11在NEC中为起保护性作用的细胞因子,并对NEC远期并发症具有一定预防作用。但这些报道均未涉及外源性应用IL-11影响NEC病变发生发展规律的系统性研究。IL-11可诱导的Jak/STAT (Janus Kinase/Signal transducer and activator of transcription, Jak/STAT)等三条主要信号通路,在维持肠道病理生理稳态、调节促炎细胞因子表达及细胞增殖与凋亡中均具有重要作用。在Jak/STAT信号转导通路中STAT3扮演着重要的角色,活化的STAT3可以诱导一系列基因的表达,对细胞的增殖与凋亡起重要的调节作用。研究表明IL-11与IL-11Ra特异性地结合形成复合物,继而使JAK激酶酪氨酸磷酸化活化,从而使STAT和受体磷酸化,形成STAT1-STAT3后发生核转位,调节其通路下游靶基因的表达。王瑞娟等发现IL-11可激活Jak/STAT信号转导通路,上调Bcl-2,同时下调Bax表达,起到抗凋亡的作用,促进肠隐窝上皮再生,保护放射性肠上皮损伤作用。本研究的前期发现,1、IL-11对新生大鼠NEC模型具有一定保护作用,能减轻肠炎,促进肠道病理形态改变,延长动物存活时间等。但对其保护机制尚需进一步探讨。Bax、Bel-2、增殖细胞核抗原(Proliferating cell neucleus antigen, PCNA)是调控细胞增殖和凋亡的重要分子,既往研究发现IL-11能够通过调节Bax/Bcl-2等蛋白的表达,从而减轻中子辐射所致的肠道损伤；IL-11可通过上调PCNA表达促进放化疗小鼠肠隐窝细胞增殖。NEC时肠道重要的病理损伤为坏死和凋亡,肠道修复需要隐窝上皮细胞增殖分化来完成。为此,我们推测,IL-11在NEC时保护作用可能与对增殖与凋亡相关分子有关。2、本基金课题前期通过脂多糖(LPS)作用于正常大鼠空肠上皮细胞系(intestinal epithelial cellNo.6,IEC-6),建立了NEC体外模型,LPS处理后,凋亡率增加,增殖活力下降,通过外源性IL-11处理,能减轻IEC-6细胞凋亡,促进其增殖。为进一步阐明NEC时IL-11的肠道保护作用,并阐明其可能发生的机制,为新的防治措施奠定理论基础。研究方法一、体内实验通过LPS、缺氧和喂养乳鼠替代品人工喂养新生大鼠,复制NEC模型,并通过应用IL-11建立治疗模型。实验分为对照组、NEC组和IL-11治疗组。1、采用HE染色技术,观察IL-11对大鼠肠道上皮细胞病理形态改变影响。2、采用TUNEL细胞凋亡检测技术,检测IL-11对大鼠肠道上皮细胞凋亡的影响。3、采用免疫组织化学技术研究IL-11对大鼠肠道上皮细胞Bax、Bcl-2和PCNA表达变化的影响。二、体外实验通过LPS作用于正常IEC-6细胞,复制NEC体外模型,并通过应用IL-11建立体外处理模型。实验分为对照组、LPS组、IL-11处理组。采用免疫印迹方法研究IL-11对大鼠肠道上皮细胞磷酸化STAT3、Bax、Bcl-2及PCNA蛋白含量的表达变化影响。三、图像分析与定量在显微镜高倍视野下(400×)：1、每张切片随机抽取5个视野,用CMIAS-Ⅰ病理图像分析系统,测定Bax、Bcl-2及PCNA表达的平均光密度(MOD)；2、测定各组IEC-6细胞P-STAT、Bax、Bcl-2及PCNA表达目的条带的相对灰度值,并进行定量分析。四、统计分析数据以均数±标准差(x±s)表示,采取one-Way-ANOVA方差分析,用SPSS11.0统计软件进行分析。研究结果一、体内实验1、新生大鼠肠道损伤的病理变化从肠道病理形态上看,正常新生大鼠的小肠绒毛整齐,肠隐窝数量较多,且形态较好；NEC3天时,可见大鼠小肠组织绒毛坏死脱落,呈秃状,隐窝数量少、结构破坏；此时IL-11治疗组大鼠小肠上皮细胞仍有肿胀表现,但程度较NEC组轻。结肠的损伤与小肠具有相似的病理改变。2、新生大鼠肠上皮细胞凋亡变化正常肠上皮细胞核呈弱阳性表达；NEC组中上述部位细胞核呈阳性表达；IL-11治疗组中阳性细胞核量较NEC组少,但仍强于正常对照组。3、新生大鼠肠组织中Bax的表达变化Bax在正常肠绒毛及隐窝上皮细胞浆呈弱阳性表达；NEC组中Bax在肠道表达显著增强；IL-11治疗组中表达较NEC组减弱,但仍强于正常对照组。定量分析结果表明,NEC时肠组织中Bax表达增加,IL-11能显著下调肠组织中Bax的表达。4、新生大鼠肠组织中Bcl-2的表达变化Bcl-2在正常肠绒毛及隐窝上皮细胞膜和细胞浆呈阳性表达；NEC组中Bcl-2在肠道表达显著降低；IL-11治疗组中表达较NEC组增强,但强度不如正常对照组。定量分析结果表明,NEC时肠组织中Bcl-2表达下降,IL-11能显著上调肠组织中Bcl-2的表达。5、新生大鼠肠组织中PCNA的表达变化PCNA在正常肠绒毛及隐窝上皮细胞核呈强阳性表达；NEC组中PCNA在肠道表达显著降低,呈弱阳性；IL-11治疗组中表达较NEC组增强,但强度不如正常对照组。定量分析结果表明,NEC时肠组织中PCNA表达下降,IL-11可上调肠组织中PCNA表达。二、体外实验1、细胞形态的变化LPS组中IEC-6细胞由原来的“石子路”状态变圆,间隙增大；加入IL-11处理后,细胞状态较原来有所改善,呈多角形,间隙增大。2、IEC-6细胞磷酸化STAT3蛋白含量的表达变化正常IEC-6细胞中存在基础性STAT3磷酸化活化；在LPS组P-STAT3蛋白表达明显减少；IL-11处理后其表达较LPS组显著增多,但仍低于正常对照组。定量分析结果表明,NEC时STAT3磷酸化活化受抑制,IL-11处理能增加磷酸化STAT3活化。3、IEC-6细胞Bax蛋白含量的表达变化正常IEC-6细胞表达一定量的Bax蛋白；LPS组显著增高；IL-I1处理组Bax蛋白含量较LPS组显著减少,但仍高于正常对照组。定量分析结果表明,LPS致IEC-6细胞损伤时,Bax表达增强,IL-11处理可抑制Bax的表达。4、IEC-6细胞Bcl-2蛋白含量的表达变化正常IEC-6细胞表达一定量Bcl-2蛋白；LPS组其蛋白含量显著减少；IL-11处理组中Bcl-2蛋白较LPS组显著增加,但仍低于正常对照组。定量分析结果表明,LPS致IEC-6细胞损伤时,Bcl-2表达减弱,IL-1l处理可上调Bcl-2的表达。5、IEC-6细胞PCNA蛋白含量的表达变化正常IEC-6细胞表达一定量PCNA蛋白；LPS组中其含量显著减少；IL-11治疗组PCNA蛋白较LPS组显著增加,但仍低于正常对照组。定量分析结果表明,LPS致IEC-6细胞损伤时,PCNA表达下降,IL-11处理可上调PCNA表达。结论一、NEC时肠道细胞凋亡增加,应用外源性IL-11治疗能减轻肠道损伤,促进肠道修复。其机制与IL-11上调Bcl-2、PCNA表达,并下调Bax表达有关。二、LPS致IEC-6细胞损伤时,应用IL-11对IEC-6细胞的保护机制可能与激活Jak/STAT信号通路中关键分子STAT3,继而上调Bcl-2、PCNA,下调Bax有关。