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人肿瘤坏死因子受体Ⅱ-Fc抗体融合蛋白(TNFR-Fc)对治疗风湿性、类风湿性关节炎疾病具有良好的疗效,拥有广阔的市场前景和巨大的经济价值。优化动物细胞大规模培养过程,提高工业化生产过程中TNFR-Fc的质和量,是其实现产业化、提升国内外市场竞争力的关键和核心所在。前期研究结果证明,在GS-CHO细胞培养过程中营养物供给、代谢副产物积累、培养环境参数控制以及细胞的生理状态是影响细胞生长和产物表达的关键问题,为此本文从认识GS-CHO细胞生长、代谢和产物合成特性入手,围绕细胞密度及其维持时间以及抗体比生成速率等影响产物表达的关键参数,深入分析培养环境参数对产物合成的影响及其作用机制,并在此基础上建立经济高效的动物细胞高密度以及TNFR-Fc高表达的流加培养过程。首先,本文通过37℃批培养实验考察了CHO细胞生长、代谢和TNFR-Fc表达的基本特性。结果发现,在批培养过程中指数生长期的细胞比生长速率为0.025 h-1,最高细胞密度可达3.19×106 cells/ml,但产物的浓度较低,只有56.83 mg/L,其比生成速率仅为3.94 pg/cell/d.葡萄糖和副产物乳酸的比消耗或比生成速率分别为3.24mmol/109cells/d和4.15 mmol/109cells/d,培养后期葡萄糖被耗竭,细胞开始大量死亡除了葡萄糖外,氨基酸也被不同程度的消耗,其中谷氨酰胺和谷氨酸消耗较多,其比消耗速率分别达到0.388 mmol/109cells/d和0.072 mmol/109cells/d。在研究过程中发现培养温度和细胞生长密度对TNFR-Fc的表达具有显著影响,为此通过反应器批培养和两阶段流加培养实验系统研究了培养温度和流加培养过程中维持的细胞密度对CHO细胞生长、TNFR-Fc比生成速率及其唾液酸含量的影响。结果发现,降低培养温度能够明显抑制细胞生长,延长细胞维持存活的时间,并显著提高了TNFR-Fc的比生成速率。与37时相比,在30℃培养条件下CHO细胞的平均比生长速率(0.002 h-1)降低了92%,培养时间延长了7 d,尤其是TNFR-Fc的平均比生成速率(15.65 pg/cell/d)显著提高了3.3倍。此外,实验发现培养温度对TNFR-Fc的唾液酸含量具有重要影响,当细胞活性高于95%时℃培养条件下获得的TNFR-Fc唾液酸含量(77μg/mg)明显高于30℃培养条件,但培养后期随着细胞活性的下降,TNFR-Fc的唾液酸含量大幅降低至43μg/mg,而在30℃培养条件下,TNFR-Fc的唾液酸含量稳定维持在60μg/mg水平,并未受到培养后期细胞活性下降的明显影响。两阶段流加培养过程中维持的细胞密度也能显著影响TNFR-Fc的表达,在维持细胞密度(6×106 cells/ml)较高的流加培养过程中TNFR-Fc的比生成速率仅为4.51 pg/cell/d,与维持较低细胞密度(2×106 cells/ml)时相比显著降低了68%,导致最终获得的TNFR-Fc浓度(296 mg/L)较低密度维持培养时反而降低了33%,CHO细胞生长和TNFR-Fc表达的最基本特征是“高密度、低表达”。此外,虽然在整个流加培养过程的维持阶段TNFR-Fc的唾液酸含量没有受到后期细胞活性降低的影响,但是高密度维持培养获得的TNFR-Fc唾液酸含量达到70μg/mg左右,高于低密度维持培养过程(60μg/mg左右)。然后从基因分子水平、蛋白质水平和细胞水平等多个层次系统研究了温度对TNFR-Fc表达的影响机制。结果发现,降低培养温度提高了葡萄糖的代谢效率,减少了乳酸的生成和积累,也降低了氨基酸的比消耗速率。与37℃培养条件相比,降低培养温度能够显著增加CHO细胞的干重、胞内蛋白含量以及G1期CHO细胞的比例,有利于TNFR-Fc的合成。通过对TNFR-Fc基因转录过程的分析发现,降低培养温度显著提高了胞内TNFR-Fc mRNA的含量,而且在培养过程中TNFR-Fc mRNA的含量变化与TNFR-Fc的比生成速率之间具有良好的对应关系,因此说明低温培养时TNFR-Fc的高比生成速率与其mRNA的高含量密切相关。进一步研究发现低温培养时TNFR-Fc mRNA稳定性的提高是其高含量的关键所在,TNFR-Fc mRNA的半衰期在37℃时为3.69 h,而在30℃时延长为5.55 h。另一方面,本文借鉴前人研究工作基础建立了描述TNFR-Fc翻译后修饰过程的动力学模型,并结合实验获得的数据,计算分析发现,与37℃培养条件相比,30℃培养条件显著提高了TNFR-Fc在内质网的折叠速率和从内质网到高尔基体的运输速率,从而促进了TNFR-Fc的表达。综上所述,细胞物质与能量代谢效率提升、生理状态改善、TNFR-Fc mRNA含量增加以及翻译后修饰效率提高是低温培养条件下TNFR-Fc比生成速率获得提升的主要原因。此外,在37℃培养条件下CHO细胞的胞内唾液酸转移酶表达水平和活性较高,有利于TNFR-Fc蛋白中的唾液酸合成,但在培养后期因细胞死亡和裂解释放的唾液酸酶在培养液中不断积累,培养到168h时唾液酸酶的活性达到7.54nmol/h/ml,是30℃培养条件下培养到360 h时的6.5倍,最终导致TNFR-Fc蛋白唾液酸残基的严重降解。而在30℃培养条件下由于细胞释放的唾液酸酶较少且其活性被该温度所抑制,因此在整个培养过程中TNFR-Fc的唾液酸含量并无显著变化。同样,本文从基因分子水平、蛋白质水平和细胞水平等多个层次进一步研究了两阶段流加培养过程中维持的细胞密度对TNFR-Fc表达的影响和作用机制。结果发现,提高维持的细胞密度并没有改变CHO细胞的代谢状态,主要营养物质(葡萄糖、氨基酸)和主要副产物(乳酸、氨)的代谢速率没有表现出明显的差异。从细胞生理状态来看,流加培养过程中维持的细胞密度并没有影响CHO细胞的干重和胞内蛋白含量,也没有影响CHO细胞的周期分布,G1期细胞的比例均在60%左右。但是提高维持的细胞密度显著降低了CHO细胞的胞内pH,在维持细胞低密度和高密度条件下CHO细胞的胞内pH分别为7.05和6.82。胞内pH的差异为探明细胞维持密度对TNFR-Fc表达的作用机制提供了非常有用的信息,进一步研究发现,高密度维持培养时胞外二氧化碳的大量积累是导致胞内pH下降的主要原因,此时其分压达到100 mmHg,远高于低密度维持培养的34 mmHg。另外,即使维持2×106 cells/ml左右的低密度培养,人为将二氧化碳分压调高至90mmHg时,TNFR-Fc的比生成速率大幅下跌至5.85 pg/cell/d,下降59%,说明二氧化碳分压以及胞内pH与TNFR-Fc的表达密切相关。对TNFR-Fc基因转录和翻译后修饰过程分析发现,两阶段流加培养过程中维持的细胞密度对胞内的TNFR-Fc基因的转录和翻译后修饰具有显著影响。其中在基因转录方面,提高维持的细胞密度会显著降低TNFR-Fc mRNA的转录速率,进而降低CHO细胞胞内TNFR-Fc mRNA含量；在翻译后修饰方面,提高维持的细胞密度也会显著降低TNFR-Fc在内质网的折叠速率和从内质网到高尔基体的运输速率。此外,在流加培养过程的降温维持阶段,虽然维持的细胞密度对唾液酸转移酶的表达水平没有影响,但是高密度维持培养时的唾液酸转移酶活性却比低密度维持培养提高了1倍,其原因可能与此条件下二氧化碳大量积累、胞内pH下降有关,因此在30℃培养条件下维持细胞高密度培养获得的TNFR-Fc蛋白的唾液酸含量明显高于细胞低密度维持培养。另外由于降温维持培养能够有效抑制唾液酸酶的活性,因此在维持培养阶段TNFR-Fc蛋白的唾液酸含量无明显变化。最后,本文以上述CHO细胞生长代谢特性为基础,充分利用有利于细胞生长和TNFR-Fc合成的培养条件,通过降低培养温度和减少二氧化碳的积累,建立了较为优化的维持细胞高密度的两阶段流加培养过程,有效克服了“高密度、低表达”的问题。与初始37℃批培养过程相比,在此两阶段流加培养过程中培养时间(312 h)延长了144 h,最大活细胞密度(10.96×106 cells/ml)和TNFR-Fc的比生成速率(15.44 pg/cell/d)分别提高了1.7倍和3.2倍,最终使TNFR-Fc的浓度(1019 mg/L)显著提高了14.6倍。此外,分离纯化后获得的TNFR-Fc蛋白唾液酸含量达到52μg/mg,符合产品质量标准的要求。通过本文的研究工作,建立了经济有效的CHO细胞两阶段流加培养过程,为TNFR-Fc的工业化生产奠定了基础。此外,本文所采用的研究方法、优化策略以及对培养温度和细胞维持密度影响TNFR-Fc的表达所取得的认识,对其它哺乳动物细胞培养过程的研究开发和抗体工业化生产过程的优化均具有重要的借鉴意义。