第一部分人CD244基因克隆及其基因转染细胞株的建立【目的】构建稳定表达人CD244基因转染细胞株。【方法】通过RT-PCR获得人CD244全长cDNA，而后进行PCR扩增；将人CD244全长cDNA重组入逆转录病毒表达载体pEGZ-Term。经测序正确后，通过脂质体法将重组逆转录病毒载体pEGZ-Term/CD244和辅助病毒载体共转染包装细胞293T；收集含有完整重组逆转录病毒颗粒的293T细胞培养上清，用以感染L929细胞和BaF细胞；采用Zeocin筛选，获得Zeocin抗性的基因转染细胞，并通过流式细胞术检测Zeocin抗性的基因转染细胞GFP和CD244的表达。【结果】成功克隆人CD244全长cDNA，并成功构建稳定表达人CD244的基因转染细胞株L929/CD244和BaF/CD244。【结论】本研究成功构建了稳定表达人CD244的基因转染细胞株，为研制鼠抗人CD244单克隆抗体和研究CD244生物学功能奠定了基础。第二部分鼠抗人CD244单克隆抗体的研制【目的】研制鼠抗人CD244单克隆抗体。【方法】以稳定表达人CD244的基因转染细胞株L929/CD244为免疫原，免疫6~8周龄的BALB/c小鼠；采用B淋巴细胞杂交瘤技术，将免疫小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，并于HAT选择性培养基中培养；以L929/CD244作为阳性筛选细胞株，并以转染pEGZ-Term空载体的L929/mock细胞株和转染重组逆转录病毒载体pEGZ-Term/CD48的L929/CD48细胞株作为阴性对照，采用流式细胞术对杂交瘤细胞进行筛选；对所得阳性杂交瘤细胞进行多次克隆化培养，直至获得持续稳定分泌特异性鼠抗人CD244单克隆抗体的杂交瘤细胞株；采用快速定性试纸法鉴定单抗亚型；采用间接免疫荧光法检测单抗特异性，并分析所获单抗对健康人PBMC中T细胞和不同来源的肿瘤细胞表面CD244分子的识别。【结果】获得l株持续稳定分泌鼠抗人CD244单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为21F8。经快速定性试纸分析鉴定，21F8的重链为IgM，轻链为κ链；腹水形成阳性率为100%，腹水的收获量平均为8ml/只。间接免疫荧光分析结果显示：单抗21F8能够特异性识别人CD244分子，并且能够识别人白血病细胞株U937和健康人PBMC中T细胞表面的CD244分子。【结论】成功获得l株持续稳定分泌鼠抗人CD244单克隆抗体的杂交瘤细胞株。