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第一部分坏死性凋亡参与压力诱导大嫉妒心鼠髓核细胞死亡的研究目的：研究坏死性凋亡是否参与压力诱导的髓核细胞死亡,分析其发生的可能性机制,并初步探讨其与自噬的相关性。方法：从大鼠胸腰椎段椎间盘提取并培养、鉴定髓核细胞,其中第2代细胞用于实验。1.0 Mpa压力下培养0h、12h、24h、36h、48h后,光镜观测细胞形态学,透射电镜观察细胞超微结构改变,cell counting kit-8 (CCK-8)检测细胞活性,流式检测定量propidium dide (PI)染色阳性率,Calcein-AM/PI染色激光共聚焦直观地观测细胞的死亡情况,实时定量PCR及Western blot检测坏死性凋亡关键分子(RIPK1、RIPK3)的基因及蛋白表达变化。通过坏死性凋亡抑制剂Nec-1、基因干扰(SiRNA-RIPK1, SiRNA-RIPK3)检测对细胞活性及死亡率的影响,免疫组化检测正常及退变椎间盘组织RIPK1,RIPK3的蛋白表达差异均引进了本实验。Nec-1预处理前后,单丹黄酰尸胺(MDC)染色流式定量自噬空泡细胞的比例,Western blot检测自噬关键分子(LC3B,Beclin-1)的蛋白表达水平。结果：随着压力培养时间的延长,光镜下细胞出现死亡加剧现象,透射电镜下见细胞呈现坏死样超微结构改变,CCK-8结果示细胞活性逐渐下降(p<0.05),流式检测示细胞死亡率逐渐升高(p<0.01)。Nec-1明显抑制压力诱导的细胞死亡、细胞活性下降(p<0.05)及坏死样超微结构改变。坏死性凋亡关键分子(RIPK1, RIPK3)的蛋白及基因表达先逐渐升高,达峰值后又降低,但各时间点表达均高于对照组Oh(p<0.01)。SiRNA-RIPK3降低压力诱导的细胞死亡,而SiRNA-RIPK1反而加剧压力诱导的细胞死亡(p<0.01)。免疫组化结果显示,退变椎间盘内(RIPK1, RIPK3)蛋白表达水平明显高于正常椎间盘,与体外实验结果一致。此外,Nec-1明显降低MDC阳性率及(LC3B,Beclin1)的蛋白表达水平(p<0.01)。结论：综合体内外实验结果,RIPK1/RIPK3可能介导压力诱导的髓核细胞坏死性凋亡发生,而RIPK1在该过程中可能发挥两面作用,RIPK1过度表达促进坏死性凋亡发生,而其适度表达则可能促进细胞生存,自噬可能是坏死性凋亡的下游途径。此结果有望为降低压力诱导的髓核细胞死亡,进而为延缓甚至阻逆椎间盘退行性变提供全新的思路。第二部分线粒体功能紊乱、氧化应激与压力诱导髓核细胞坏死性凋亡的相关性研究目的：探讨压力诱导的髓核细胞坏死性凋亡与线粒体功能紊乱、氧化应激的相关性,并初步探讨RIPK1在其中发挥的作用。方法：从大鼠胸腰椎段椎间盘提取并培养、鉴定髓核细胞,其中第2代细胞用于实验。RIPK1激酶抑制剂Nec-1预处理细胞,在1.0 MPa压力条件下培养24h、36h后,荧光探针JC-1染色后流式及激光共聚焦检测线粒体膜电位(mitochondrial transmembrane potential, MTP)变化,MPTP荧光试剂盒检测线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)改变情况,荧光探针H2DCF-DA染色后流式及激光共聚焦检测细胞活性氧(ROS)表达水平,透射电镜检测线粒体超微结构改变,荧光酶标仪检测细胞ATP水平变化。酶标仪检测脂质氧化酶丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性变化。此外,为验证RIPK1与氧化应激水平的上下游关系,抗氧化剂N-acetyl-L-cysteine (NAC)预处理后,实时定量PCR及Western blot定量RIPK1的基因、蛋白表达水平变化。结果：压力作用24h、36h后,线粒体膜电位明显下降(p<0.01)、膜通透性转换孔开放明显增加(p<0.01)、透射电镜示线粒体嵴消失、呈现大量空泡化、ATP严重耗竭(p<0.01),提示线粒体功能严重受损,而Nec-1明显抑制压力诱导的线粒体膜电位下降(p<0.01)、膜通透性增加(p<0.01)、线粒体空泡化超微结构改变及ATP水平耗竭等(p<0.01)。随着压力培养时间的延长,氧化应激指标ROS及MDA活性均逐渐升高,抗氧化指标SOD活性逐渐下降,提示压力条件下氧化应激水平逐渐升高(p<0.01)。 Nec-1能明显降低ROS、MDA的活性水平,并同时提高SOD的活性(p<0.01),表明Nec-1降低压力诱导的氧化应激水平升高。同时,抗氧化剂NAC对压力诱导的RIPK1蛋白及基因表达水平基本无影响(p<0.001)。结论：Nec-1能明显抑制压力诱导的线粒体功能紊乱及氧化应激水平,结合抗氧化剂NAC对RIPK1的基因及蛋白均表达无明显影响,提示RIPK1介导的线粒体功能紊乱及氧化应激在压力诱导髓核细胞坏死性凋亡过程中可能发挥关键性作用。调控压力条件下髓核细胞线粒体功能及氧化应激水平有望为降低压力诱导的髓核细胞死亡,进而为延缓甚至阻逆椎间盘退行性变提供全新的思路。