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人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)是一种酪氨酸激酶受体,该受体在多种类型的肿瘤中过表达,HER2过表达与患者的不良预后密切相关。曲妥珠单抗(Trastuzumab,Herceptin)是一株靶向HER2胞外段结构域Ⅳ区的人源化抗体,已获美国食品及药物管理局(FDA)批准用于HER2高表达的乳腺癌及胃癌的临床治疗。然而,随后的研究发现,大部分HER2高表达乳腺癌患者对Trastuzumab不产生反应(即原发性Trastuzumab耐药),初期对Trastuzumab产生反应的患者有半数也会在1年内产生耐药(即获得性Trastuzumab耐药)。在胃癌的治疗中同样存在这一情况。帕妥珠单抗(Pertuzumab)是另一株靶向HER2胞外段结构域II区的人源化抗体。Trastuzumab和Pertuzumab具有协同的抗肿瘤作用,故二者联合用药被FDA批准为一线治疗方案。尽管临床试验证实Trastuzumab和Pertuzumab的联合用药能部分克服Trastuzumab耐药,但仍存在客观反应率及完全反应率低的问题。因此,克服Trastuzumab的原发性及获得性耐药问题仍是基础研究和临床治疗的迫切需求。原发性Trastuzumab耐药与获得性Trastuzumab耐药在发生机制上并不相同,在治疗方案上也应区别对待。前期研究中,我们课题组通过噬菌体展示技术筛选得到一株新的抗HER2全人源单克隆抗体H2-18,该抗体与HER2的胞外段结构域I区特异性结合,可通过诱导细胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD)的方式克服原发性Trastuzumab耐药。本课题中,我们一方面研究了H2-18在获得性Trastuzumab耐药细胞中的抗肿瘤作用,另一方面研究了H2-18与Trastuzumab、Pertuzumab联用在胃癌中的抗肿瘤作用。一、H2-18在获得性Trastuzumab耐药细胞中的抗肿瘤作用我们将一株Trastuzumab敏感胃癌细胞株NCI-N87培育成获得性Trastuzumab耐药细胞株NCI-N87-TraRT。鉴于H2-18克服Trastuzumab原发性耐药的机制在于有效诱导细胞发生PCD,我们首先通过Annexin V与PI双染检测药物处理后细胞的死亡情况。结果发现,在NCI-N87及NCI-N87-TraRT细胞中,H2-18均能显著的诱导细胞PCD,呈浓度依赖性,而其他抗体均不能产生这种作用。相比NCI-N87细胞,在NCI-N87-TraRT细胞中H2-18能诱导更高比率的PCD。在BT-474与BT-474TraR细胞中也得到了相同的结果。随后,我们通过增殖抑制实验检测药物对NCI-N87及NCI-N87-TraRT细胞的体外增殖抑制活性。结果发现,H2-18对两株细胞的增殖抑制作用并无差异。在NCI-N87细胞中,H2-18的增殖抑制作用弱于Trastuzumab单用,而在NCI-N87-TraRT细胞中,H2-18的增殖抑制作用超过了Trastuzumab的单用。我们进一步通过裸鼠皮下移植瘤模型对药物的体内抗肿瘤作用进行研究,结果发现,在NCI-N87细胞肿瘤模型中,H2-18的抑制肿瘤生长作用与Trastuzumab单用相近,但弱于Trastuzumab与Pertuzumab的联用,而在NCI-N87-TraRT移植瘤模型中,H2-18的抑制肿瘤生长作用远强于Trastuzumab的单用,并优于Trastuzumab与Pertuzumab的联用。为了探讨H2-18在获得性Trastuzumab耐药细胞中的抗肿瘤作用机制,我们使用蛋白印迹法检测药物对NCI-N87及NCI-N87-TraRT细胞HER2下游信号通路的作用。结果发现,在NCI-N87细胞中,H2-18对HER3、AKT、ERK的磷酸化能产生抑制作用,而在NCI-N87-TraRT细胞中,H2-18对HER3、AKT、ERK的磷酸化的作用微乎其微。进一步的研究发现,在两株细胞中,H2-18均能引起细胞内活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的升高,同时伴JNK与c-jun磷酸化的上调,而当使用ROS清除剂或使用SiRNA沉默JNK、c-jun后,H2-18诱导的细胞PCD均明显下降。因此,我们推测在获得性Trastuzumab耐药细胞中,H2-18仍可通过RIP1-ROS-JNK-c-jun通路有效诱导细胞的死亡,进而克服Trastuzumab的获得性耐药。二、H2-18与Trastuzumab、Pertuzumab联用在胃癌中的抗肿瘤作用我们首先通过蛋白印迹法及流式法对多株胃癌细胞HER2表达情况进行检测。结果发现,只有在NCI-N87细胞株以及本实验室自行培育的NCI-N87-TraRT细胞株中存在HER2的高表达。我们通过增殖抑制实验检测药物联用对胃癌细胞的体外增殖抑制活性。结果发现,在HER2高表达的NCI-N87及NCI-N87-TraRT细胞中,Trastuzumab与Pertuzumab联用的增殖抑制作用要强于Trastuzumab、Pertuzumab、H2-18各自的单用,而Trastuzumab与H2-18联用的增殖抑制作用超过了Trastuzumab与Pertuzumab联用,H2-18、Trastuzumab、Pertuzumab三者的联用表现出最强的抑制活性。用CompuSynsoware软件拟合之后发现H2-18与Trastuzumab联用或H2-18、Trastuzumab、Pertuzumab三者联用均具有协同的抗肿瘤作用。而在HER2低表达的胃癌细胞中,均未发现这一这结果。我们进一步使用平板克隆实验检测药物联用对细胞增殖能力的作用。结果发现,在NCI-N87细胞中,H2-18与Trastuzumab联用较Trastuzumab与Pertuzumab联用对克隆形成都有一定的抑制作用且作用效果相近,在NCI-N87-RraRT细胞中,H2-18与Trastuzumab联用对克隆形成的抑制作用超过了Trastuzumab与Pertuzumab联用,而在两株细胞中,Trastuzumab、Pertuzumab、H2-18联用均表现出最强的克隆形成抑制作用。我们同样通过裸鼠皮下移植瘤模型对药物联用的体内抗肿瘤作用进行研究。结果发现,在两株细胞移植瘤模型中,H2-18与Trastuzumab联用对裸鼠皮下移植瘤抑制作用均超过了Trastuzumab与Pertuzumab联用,Trastuzumab、Pertuzumab、H2-18三者联用同样表现出最强的肿瘤抑制作用。进一步的研究发现,在胃癌细胞中,抗体联用组对HER3、AKT、ERK磷酸化的抑制要强于各抗体的单用,H2-18与Trastuzumab联用较Trastuzumab与Pertuzumab联用对HER3、ERK、AKT磷酸化的抑制作用相近,Trastuzumab、Pertuzumab、H2-18三者联用对HER3、AKT、ERK的磷酸化表现出最强的抑制作用。更重要的是H2-18单用或是H2-18与Trastuzumab、Pertuzumab联用均能引起细胞PCD,同时伴ROS升高以及JNK、c-jun磷酸化的上调,而Trastuzumab与Pertuzumab的单用或是联用均不能引起ROS-JNK-c-jun通路的改变。因此,我们推断H2-18与Trastuzumab、Pertuzumab联用均具有协同抗肿瘤作用的机制在于同时抑制胃癌细胞下游PI3K/AKT及RAS/MAPK信号传导通路以及H2-18通过HER2胞外I区有效诱导细胞PCD。综上所述,H2-18与Trastuzumab、Pertuzumab联用在Trastuzumab耐药的胃癌中均展现出良好的体内外抗肿瘤作用,提示这样的药物组合有望成为克服Trastuzumab耐药的新型方案。