鸳鸯茉莉（Brunfelsia acuminate）花的颜色在几天内从深紫色变为白色，因开花时间不同，所以在同一植株上能看到许多不同的颜色，具有极高的观赏价值。本研究以鸳鸯茉莉花瓣为试材，利用RT-PCR和RACE技术，克隆了花色素苷生物合成途径中反应关键酶基因：查尔酮合成酶（CHS）、查尔酮异构酶（CHI）及类黄酮-3′,5′-羟化酶（F3′5′H）基因cDNA的全长，同时利用染色体步移技术克隆得到CHS基因启动子区序列。通过对鸳鸯茉莉花瓣色素相关基因的克隆及分析，以期为进一步了解鸳鸯茉莉花色素苷合成分子机制，也为利用基因工程改变花色奠定基础。1鸳鸯茉莉花瓣查尔酮合成酶（CHS）基因cDNA全长和启动子的克隆利用RT-PCR和RACE技术获得鸳鸯茉莉花瓣CHS基因cDNA全长序列（全长为1415bp），其Genbank登录号为JN966986。该序列包含一个1170bp的开放阅读框，73bp的5′UTR和172bp的3′UTR，共编码389个氨基酸。经过同源性比较，鸳鸯茉莉花瓣CHS基因序列与矮牵牛（Petunia hybrida）、烟草（Nicotiana tabacum）、西红柿（Solanum lycopersicum）、甜椒（Capsicum annuum）、野茶树（Camellia sinensis）的同源性分别为：90%、88%、85%、84%、79%。经生物信息学分析得出，鸳鸯茉莉花瓣CHS蛋白分子量和等电点分别为42,699D和6.57，属于稳定、亲水性蛋白，分子式为：C1901H3046N516O562S18；二级结构预测其主要组成元件为α螺旋和β折叠，不含信号肽，但含有两个跨膜结构域分别位于208²25区和369³88区，亚细胞定位于细胞质中的可能性最大；保守结构域分析分析表明，该蛋白包含一个缩合酶家族区域。利用染色体步移技术，通过3轮巢式热不对称交错式PCR，获得769bp的启动子序列。经Blast序列比对，540⁶78区与矮牵牛启动子的同源性为87%，444⁶45区与烟草启动子的同源性为75%。利用SoftBerry软件预测，转录起始位点位于第653bp处的A；利用PlantCARE软件分析，除发现TATA-box（TATATAAA）、CAAT-box（TGCCAAC）等核心启动子的保守元件，还发现一些重要的顺式作用元件，如与光响应相关的G-box、Box I、Box IV、I-box、GT1-motif元件，与激素响应相关的ABRE、ARE、P-box、TGACG-motif、TGA-element元件，与生物周期调节相关的circadian元件，HSE、Skn₁motif等其他一些顺式作用元件。这些作用元件与花色积累影响因素相一致，可以推测本研究克隆得到的鸳鸯茉莉CHS基因5′端调控序列具有植物启动子的基本特征。2鸳鸯茉莉花瓣查尔酮异构酶（CHI）基因cDNA全长的克隆利用RT-PCR和RACE技术获得鸳鸯茉莉花瓣CHI基因cDNA全长序列（全长为1051bp），其Genbank登录号为JN887637。该序列包含一个792bp的开放阅读框，22bp的5′UTR和237bp的3′UTR，共编码263个氨基酸。经过同源性比较，鸳鸯茉莉花瓣CHI基因序列与矮牵牛、烟草、金花茶（Camellia nitidissima）、茄子（Solanummelongena）、橄榄（Canarium album cultivar Changying）、甜樱桃（Prunus avium）、杜鹃花（Rhododendron simsii）、牡丹（Paeonia suffruticosa）、芍药（Paeonia lactiflora）、菊花（Chrysanthemum x morifolium）的同源性分别为84%、82%、76%、81%、72%、73%、75%、73%、72%、71%。经生物信息学分析得出，鸳鸯茉莉花瓣CHI蛋白分子量大小和等电点分别为28.54kD和4.91，属于不稳定、亲水性蛋白，分子式为C₁₂₈₄H₂₀₂₅N₃₁₉O₄₀₃S₅；二级结构中以α螺旋和β折叠为主；不含信号肽，存在一个跨膜结构域位于149¹67区；亚细胞定位于细胞质的可能性最大；保守域结构预测表明，该蛋白含有一个查尔酮超级家族区域。3鸳鸯茉莉花瓣类黄酮-3′,5′-羟化酶（F3′5′H）基因cDNA全长的克隆利用RT-PCR和RACE技术获得鸳鸯茉莉花瓣F3′5′H基因cDNA全长序列（全长为1702），其Genbank登录号为JQ678765。该序列包含一个1521bp的开放阅读框，120bp的5′UTR和61bp3′UTR，共编码506个氨基酸。经过同源性比较，鸳鸯茉莉花瓣F3′5′H基因序列与矮牵牛、高杯花（Nierembergia sp.）、马铃薯（Solanumtuberosum）、长春花（Catharanthus roseus）、野茶树（Camellia sinensis）、洋桔梗（Eustomagrandiflorum）等植物的同源性分别为91%、87%、83%、76%、74%、73%。经生物信息学分析，鸳鸯茉莉花瓣F3’5’H蛋白分子量和等电点分别为56.47kD和8.78，属于稳定、亲水性蛋白，分子式为C₂₅₄₁H₄₀₅₅N₆₈₁O₇₁₄S₂₈。二级结构中以α螺旋和β折叠为主，不含信号肽，存在4个跨膜结构，分别位于1²6区、39⁵8区、170¹90区、442⁴64区；亚细胞定位于内质网膜的可能性最大。保守域结构预测表明，该蛋白含有一个细胞色素P450超级家族区域。