论文部分内容阅读
目的: 1、通过5种不同的处理方法拟构建5组不同肠道菌群状态的大鼠模型,使用Illumina高通量测序技术对各组模型肠道菌群的结构特点进行分析,研究肠道微生态与非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)病变的关联及其在疾病中的作用。 2、使用焦磷酸测序技术测定各组大鼠脂联素基因DNA启动子区甲基化水平,并与肠道微生态的关系进行探讨性分析,研究肠道菌群是否通过影响脂联素基因DNA启动子区甲基化表达水平,引起低脂联素血症,从而导致NAFLD的发生。 方法:50只雄性SD大鼠随机分为5组,分别为正常普通饲料组(A组)、正常高脂饲料组(B组)、紊乱普通饲料组(C组)、紊乱高脂饲料组(D组)、紊乱高脂饲料培菲康组(E组),每组10只,其中后3组使用高剂量抗生素头孢曲松溶液灌胃,建立肠道菌群紊乱模型,C组饲以普通饲料、D组为高脂饲料、E组高脂饲料喂养同时使用益生菌灌胃,且在喂养期间,继续饮用低浓度头孢曲松溶液以保持肠道菌群失调状态;前2组生理盐水灌胃,作为肠道菌群正常模型,分别饲以普通饲料、高脂饲料。13周后收集血、肝脏及盲肠粘膜等标本,检测血脂、肝功能指标,行HE染色及massonran染色明确肝组织病变程度,采用ELISA法测定血清脂联素水平,提取肝脏DNA行16rDNA焦磷酸测序测定肝脏APN启动子区甲基化水平以及提取粘膜组织DNA行16S rDNA高通量Illumina测序检测肠道微生态变化。 结果:高脂喂养的B、D、E组均能成功造模非酒精性脂肪性肝病大鼠,将检测得到的各项指标分别进行组内(A组与B组、C组与D组、D组与E组)及组间(A组与C组、B组与D组)对比得到以下结果: 1、大鼠体重、肝湿重及肝脏指数:13周末对全部大鼠称重,喂食高脂饲料的SD大鼠体型消瘦,体重轻,B、D组体重分别较正常饲料的A、C组体重下降,但肝重和肝指数显著增加,且P<0.01。E组与D组、A组与C组及B组与D组相比,各项指标均无明显差异。 2、肝脏病理学变化:8周后,A组及C组普通饲料喂养大鼠肝脏细胞无脂肪变性,B组、D组、E组喂养高脂饮食后出现明显的肝脏脂肪变性。13周后,各组大鼠肝脏HE染色显示,正常普通饲料组(A组)肝结构完整,肝细胞正常,胞内未见脂滴浸润。紊乱普通饲料组(C组)肝组织结构基本正常,仅见散在少量脂滴。正常高脂饲料组(B组)呈单纯性 NAFLD改变,为小泡性脂肪变,少量炎细胞侵润,紊乱高脂饲料组(D组)出现明显的肝脂肪变性及炎细胞浸润。紊乱高脂饲料培菲康组(E组)肝细胞脂肪变性及炎症浸润程度改善,多为小泡性脂肪变。Masson染色显示,D组部分大鼠肝脏汇管区纤维组织增生,周围可见纤维间隔形成。 3、血清生化指标:NAFLD大鼠模型B、D、E组肝功能存在不同程度损伤,组内比较的A组与B组以及C组与D组之间差异有统计学意义。血清TC及血清D-LDL浓度,B组与D组分别比A组与C组明显升高,差异均有统计学意义;血清HDL-C浓度,C组比A组、D组高,差异有统计学意义,其余组别间无差异。各组血清TG浓度均无差异。 4、血清APN水平:各组大鼠血清APN含量:除D组血清APN浓度明显降低外,A组、B组、C组、E组均无明显下降。组间比较中,B组与D组比较存在明显差异。组内比较中,C组与D组及D组与E组之间的差异有统计学意义。 5、肝脏APN启动子区甲基化水平:在APN启动子区的10个检测位点中,B组和D组NAFLD大鼠肝脏APN的甲基化程度存在明显差异,在位点2、位点6、位点9等3个位点,D组甲基化水平高于B组,有统计学意义,而在其它7个CpG位点甲基化水平无明显差异,并且其它大鼠各组间在10个检测位点中均无明显差异。 6、肠道微生态变化:通过OTU及其丰度分析显示,不同的处理条件会对大鼠肠道菌群造成不同的影响。未经抗生素处理的大鼠肠道菌群结构与经抗生素处理大鼠的结构显著不同,高脂饮食与普通饮食的大鼠肠道菌群亦存在差异。通过OTU统计及OTU Rank曲线可知A、B组大鼠肠道菌群的丰富程度(以A组最为丰富)明显比C、D、E组(D组减少最为明显)高,提示抗生素的不利因素可以降低物种的多样性。OTU主成分分析显示,A、B组和C、D、E组各自聚集,区分良好,说明各组大鼠的肠道菌群中物种组成相似性低,存在差异,其中A组与B组离散程度大,各占不同空间,说明样品组成在无抗生素干预的情况下,高脂饮食对菌群的影响占主要地位,D组因有抗生素及高脂喂养的双重作用,肠道菌群多样性是所有组别中减少最严重的一组。在物种及其丰度分析中,发现在不同分类水平上,不同组间物种的构成有其独特的核心微生物,且不同物种在每个样品中所占比例亦不相同。在样品组间显著性差异分析中,使用统计学方法在门、属、种分类等级上检验两组样品间微生物群落丰度的差异,筛选出导致两组样品组成差异的物种。结果显示肠粘膜菌群在各分类水平上,高脂饮食、抗生素等对门水平的种类影响较少,但对物种的组成比例影响较大,主要表现为厚壁杆菌门/拟杆菌门的比值减小,而在属水平,种类间变化则较大,主要的有益菌乳酸杆菌属在组间比较中大部分存在差异,且有统计学意义,而双歧杆菌属、埃希氏菌属及肠球菌属均无明显改变。 7、肠道菌群与脂联素甲基化之间的相关性分析:选择B组与D组中3个有差异位点的脂联素甲基化率,并将它们与双歧杆菌和肠球菌在属水平的丰度比值(B/E值)进行线性相关分析,发现两者无明显相关性。 结论: 1.高脂饮食和(或)抗生素建立的各组大鼠模型存在肠道菌群多样性的改变,表现为物种结构的减少及物种丰富程度的下降两个方面。 2.肠道菌群的变化与NAFLD的形成存在明显的相关性,肠道菌群多样性变化越大,NAFLD的脂肪变及炎症程度越严重。 3.肠道菌群失调程度与脂联素基因DNA启动子区甲基化水平无相关性,但并不能就此否认两者的相关性,可能需要增大样本量及寻找更适合的统计学方法进行分析说明。 4.此实验的临床意义是:代谢综合征、糖尿病等容易引起肠道菌群失调,增加并发NAFLD风险的患者,可进行微生态调节药物的早期干预,预防及减缓NAFLD的发生。