从噬菌体展示随机肽库中定量筛选人血清白蛋白黏附肽的研究

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人血清白蛋白(Human Serum Albumin, HSA)约占人体血浆总蛋白的50%-60%,半衰期可达到19天,在体内起着维持血液渗透压、运输营养和保护其他重要生物物质的作用,它是血液中重要的物质输送和药物运输载体,也是是药物设计理想的载体蛋白。以人血清白蛋白为载体的纳米药物正在逐步兴起,它可以提高药物的稳定性、缓释药物从而延长其作用的时间,而且可达到靶向输送的目的。除了与人血清白蛋白融合,黏附人血清白蛋白也已成为改善蛋白质药物药代动力学特性的策略。人血清白蛋白黏附方法延长蛋白质药物半衰期的关键是要有特异性和亲和力高的人血清白蛋白黏附肽。本文利用噬菌体表面展示技术(Phage Display Technology,PDT),以人血清白蛋白为靶分子,利用甘氨酸-盐酸(pH2.2)为洗脱液对噬菌体随机七肽库进行生物淘选,并以回收率和选择比双重标准定量优化淘选过程。回收率是洗脱得到的噬菌体量与投入的噬菌体量的比值;选择比(P/B)是人血清白蛋白包被板与对照空白板上洗脱噬菌体量的比值。通过包被、结合、洗脱、扩增的步骤连续淘洗4轮后,回收率从第一轮的1.97×10-6上升到第四轮的1.49×10-4,选择比也从第二轮的3.6上升到了第四轮的7.1,说明得到与靶分子特异性结合的外源蛋白或多肽。利用回收率和选择比双重标准定量优化淘选过程,更加确保了实验的可行性和准确性。另外利用选择比还可以对人血清白蛋白特异性黏附肽进行初步筛选。挑取噬菌体单克隆进行特异性鉴定,成功的挑选出一些可以与HSA特异性结合的噬菌体阳性克隆。本文使用滴度测定的方法成功地对所挑选的噬菌体阳性克隆进行了相对亲和力的测定,此方法简单易操作,最终得到了四个特异性黏附肽的序列。筛选出的4个特异性人血清白蛋白黏附肽没有同源序列,说明其黏附的可能是人血清白蛋白的不同部位。本文以噬菌体滴度测定的方法测得的亲和力为0.73μM、0.42μM、0.81μM和0.15μM。噬菌体展示表面技术是将外源DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因中,与外壳蛋白融合表达,通过表型筛选获得其编码基因。噬菌体展示技术作为研究蛋白质与蛋白质相互作用的重要工具,在功能基因组的研究中发挥着巨大的作用。
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