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单核细胞增多性李斯特菌（listeria monocytogenes,LM）作为四大重要食源性病原菌之一,对人类及多种畜禽健康威胁极大,可以突破宿主的肠道屏障,血脑屏障和血胎屏障,临床上引起肠胃炎、脑膜脑炎、败血症、流产等症状,尤其是对幼龄和妊娠母畜,发病急,死亡率高。LM细胞胞壁表面分布多种毒力蛋白,在感染机体过程中发挥重要作用,其中有一类至关重要的表面蛋白的前体蛋白C端含有保守基序LPXTG,Srt A是一种分选酶能够识别表面蛋白C末端的保守基序LPXTG,共价结合到肽聚糖上,呈现在细胞表面发挥毒力作用,是毒力蛋白可以锚定到细菌细胞壁过程中的关键。本研究以李斯特菌病绵羊脑组织临床分离的单核细胞增多性李斯特菌（简称LM90SB2,4b血清型）为研究对象,首先对LM90SB2的srt A基因进行序列分析及原核表达;构建LM90SB2的srt A基因缺失株（LM90SB2-△srt A）,对比分析生化特性,生长特性,对小鼠和不同种属类型细胞的毒力等生物学功能,为探究LM的Srt A分选的蛋白谱,寻找新的毒力蛋白研究奠定了重要基础;在LM致病机理研究中和药物靶标的筛选上同样具有重要作用。1.LM90SB2 srt A基因的序列分析与原核表达:为了探究LM90SB2的srt A基因的特异性及其在原核表达质粒p ET32a中的表达。利用PCR技术扩增LM90SB2的srt A基因,测序后用DANMAN软件与已公布的标准株进行序列比对分析,将srt A克隆到原核表达质粒p ET32a中构成重组表达质粒p ET32a-srt A。质粒p ET32a-srt A转化到蛋白表达菌株E.coli BL21（DE3）中,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导使其表达,SDS-PAGE电泳检测,同时采用Western-blotting对表达产物进行了鉴定。实验结果表明:LM90SB2与标准株LMF2365（serovar 4b,NC002973）srt A基因的核苷酸同源性为100%;Srt A蛋白在BL21（DE3）中大量表达,表达产物经SDS-PAGE电泳和Western-blotting检测分析其为一个分子量为47k D的融合蛋白与预期的大小相符合。2.LM90SB2 srt A基因缺失株（LM90SB2-△srt A）的构建与鉴定:基因缺失是研究基因功能常用的方法,本实验利用同源重组的方法构建LM90SB2 srt A基因缺失株（LM90SB2-△srt A）,为研究LM的srt A基因的功能奠定基础。用Primer 5.0软件设计融合引物,PCR扩增LM90SB2 srt A基因的上下游同源臂,运用融合PCR（SOE-PCR）的方法连接上下臂获得缺失srt A基因的同源片段（△srt A）,连接到p MD19-T构成p MD19-T-△srt A,基因测序结果正确后将△srt A克隆到质粒p KSV7中构成重组质粒p KSV7-△srt A。将质粒p KSV7-△srt A电转化入LM90SB2中,筛选阳性克隆,在高温和10μg/ml氯霉素抗性条件下连续传代,发生同源重组,用两对引物（srt AF1和srt AR2,srt AF和srt AR）PCR验证缺失片段。再置于无抗性的30℃条件下连续传代获得稳定的srt A基因缺失株LM90SB2-△srt A。在无氯霉素抗性的BHI液体培养基中,37℃,180 rpm条件下连续传代培养20代,PCR检测无毒力返祖现象,表明该缺失株具有良好的遗传稳定性。3.对比分析LM90SB2-△srt A部分生物学特性:对比分析缺失株LM90SB2-△srt A与野生株LM90SB2的部分生物学特性的差异,来探究srt A基因对于LM90SB2毒力的影响。本实验主要对比分析了细菌的生化特性、溶血效价、耐酸耐碱性、生物膜形成能力;对于MBMEC,HBMEC,RAW264.7,SIEC的粘附,侵袭和胞内增殖能力以及对BALB/c小鼠的致病能力影响。结果表明:srt A基因的缺失后,LM90SB2的生化特性、耐酸耐碱性无变化;溶血效价、生物膜形成能力稍有差异;LM90SB2对不同细胞的粘附、侵袭和胞内增殖能力不同,对RAW264.7的感染效率最高,对脑细胞的感染效率相对较低;srt A基因缺失后显著降低了LM90SB2对HBMEC,RAW264.7,SIEC细胞的粘附率和对MBMEC,RAW264.7,SIEC细胞的侵袭率（P<0.05）,对LM90SB2在MBMEC,HBMEC,RAW264.7,SIEC中的增殖趋势未有明显影响,但细菌含量有所降低;srt A基因缺失后LM90SB2对BALB/c雌性小鼠的LD50值升高了1.63个对数级,在感染了4天后小鼠的肝脏、脾脏和脑中的含菌量有所降低。表明srt A基因缺失后LM90SB2对细菌和细胞的侵染能力有所下降。