背景：结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, M.tb)感染引起的结核病(Tuberculosis, TB)是全球三大传染病杀手之一。据2015年最新流行病学统计,每年新增结核病例960万,导致150万死亡。全球约有1/3人口感染结核,其中90-98%为潜伏感染,其中2-10%会发展为活动性结核,加之耐药株的流行、与HIV或HCV共感染等情况使得该疾病严重威胁着人类健康。近年来,结核病在诊断、预防及致病机制的研究方面虽然已取得了一定进展,但仍存在许多不足,需要进一步地完善及深入。目前,结核病的诊断主要依赖胸片、痰涂片抗酸染色、TST、PCR、微生物培养等手段；但这些方法或灵敏度低、或检查周期长。近年来发展的IFN-γ释放检测试验(IGRAs)具有了较高的灵敏度及特异度,但该类型检测试剂盒是仅以ESAT-6、CFP10多肽为刺激抗原使诊断仍存在漏检情况。在结核病预防方面,唯一可用的疫苗是卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin, BCG),但仅能为未成年儿童提供可靠的保护性,成人中免疫保护性非常低下。已有研究显示重组BCG为改良疫苗的最佳方法,但难点在于寻找合适的靶标抗原。筛选优势靶标抗原不仅可用于提高诊断率还可应用于疫苗研究。巨噬细胞是结核分枝杆菌寄生的主要宿主细胞,部分结核分枝杆菌可逃避宿主免疫系统、尤其是巨噬细胞的追杀。但具体机制尚不清楚,深入了解结核分枝杆菌与宿主巨噬细胞相互作用的机制和途径,对于解释结核分枝杆菌致病机理特别是它在巨噬细胞中长期寄生的原因有着重要的作用。BCG基因组中的某些片段相对于牛型结核分枝杆菌或结核分枝杆菌H37Rv来说发生缺失,这些缺失片段被定义为RD区(Region of Differences, RD)。基因芯片技术研究发现BCG较H37Rv丢失了RD1-16区,近年来许多研究报道显示,许多该丢失区域所表达的蛋白中有很多功能性蛋白,包括具有很强的免疫原性的基因、介导免疫逃逸的基因等。目的：筛选RD区中优势免疫原性抗原,评估其在结核诊断中的用途；利用该RD抗原构建能增强BCG免疫原性的新型重组BCG疫苗(rBCG::Rv2645);筛选RD区中可能存在的抗巨噬细胞杀伤基因,探讨结核分枝杆菌的逃逸机制。方法：本研究通过构建RD10-14区基因的31种原核表达质粒、表达纯化相应RD蛋白、ELISPOT等方法筛选出优势免疫原性抗原。以该蛋白作为结核特异性抗原评估其诊断用途。同时,利用电转技术将该RD基因导入BCG中构建重组疫苗rBCG::Rv2645,通过免疫Balb/c、鼠、恒河猴后,评估其免疫原性及H37Rv攻毒后的抗结核免疫保护能力。另外,利用表达RD蛋白建立的BL21-RDs菌种库,筛查这些RD蛋白对巨噬细胞的影响；通过巨噬细胞吞噬试验及菌落计数、LDH释放实验等筛选出能抗巨噬细胞杀伤的RDs基因,从而进一步探讨该蛋白与巨噬细胞的相互作用机制。结果：本研究首次从RD10-14区中筛选出来源于RD13区的分泌型蛋白Rv2645能刺激T淋巴细胞产生高水平特异性的IFN-γ,Rv2645特异性1FN-y水平在结核病人PBMCs中明显高于健康人(包括BCG接种者)；在结核病人与健康人的鉴别诊断中,Rv2645的检测灵敏度与特异度高达90.0%、98.2%,其中结核病人的诊断结果与临床上使用CFP10-ESAT6为刺激抗原的T-SPOT.TB诊断结果相比,相符率可达98%。但Rv2645与CFP10-ESAT6联合使用后比单独使用CFP10-ESAT6或Rv2645抗原效果更好,能将灵敏度从88.0%左右提升至96.0%,且具有类似高特异度98.2%；且Rv2645特异性皮肤试验可区分结核感染及BCG接种人群。我们还成功构建了重组疫苗rBCG::Rv2645;在Balb/c小鼠及恒河猴的动物实验中发现,相对于BCG而言,rBCG::Rv2645能提升更高的免疫原性及抗结核免疫保护作用。另外,本研究发现来源于RD14区的Rv1768 (PE-PGRS31)基因能逃逸巨噬细胞的杀伤。进一步的研究发现Rv1768是通过与巨噬细胞的Annexin A2结合从而降低胞内钙离子浓度,进一步抑制了吞噬溶酶体的成熟。结论：本研究首次发现的Rv2645蛋白是结核病T细胞免疫的特异性识别抗原,在结核诊断试剂开发及结核疫苗设计方面具有一定的潜力；另外,所筛选的Rv1768抗原为结核杆菌逃逸机制的探讨提供了新方向。