论文部分内容阅读
目的:维持基因组的稳定性是正常机体发育所必需的,并且对于预防癌症等疾病至关重要。基因的信息被包装进了染色质中,越来越多的证据表明染色质的环境在DNA损伤应答中起了重要作用。但是,目前尚不完全清楚DNA修复是如何被表观机制所调控的。本论文旨在研究赖氨酸特异的组蛋白去甲基化酶KDM5B在DNA双链损伤应答的各个方面所发挥的作用。方法与结果:1)通过细胞核内蛋白质组分分离实验,发现在DNA损伤应答时,KDM5B可以更多的与染色质结合;2)在细胞内经稳定转染引入核酸内切酶I-Sce1/AsiSI的识别序列,过表达I-Sce1/AsiSI核酸内切酶质粒诱导DNA双链损伤,通过染色质免疫共沉淀(Ch IP)实验,发现KDM5B可以被招募到DNA双链损伤位点附近的染色质区域;3)通过免疫共沉淀实验,发现KDM5B与PARP1有相互作用,并且此作用在DNA损伤时增强,与之相对应的,损伤时KDM5B的多聚腺苷二磷酸核糖化水平增高;4)分离与染色质相结合的细胞核蛋白及全细胞裂解液发现,敲低PARP1会影响DNA损伤时KDM5B与染色质的结合,若加入PJ-34(PARP1的酶活性抑制剂),也会影响KDM5B在染色质上的富集。通过定量染色质免疫共沉淀(qCh IP)实验,发现无论是PARP1的酶活性还是其与KDM5B的结合都影响KDM5B富集在DNA损伤区域的染色质上;5)利用NHEJ-GFP系统以及HR-DRGFP系统,通过FACS发现DNA双链损伤时,KDM5B能影响NHEJ及HR的修复效率;6)引入KDM5B无酶活性的突变体,利用NHEJ-GFP系统以及HR-DRGFP系统,通过流式细胞仪,发现KDM5B在DNA损伤中的作用依赖其去甲基化酶活性;进一步通过染色质免疫共沉淀(ChIP)实验,发现KDM5B能改变DNA损伤区域染色质的H3K4me3水平;7)通过免疫荧光实验以及peptide pull-down实验发现,DNA发生损伤时,KDM5B能招募BRCA1至损伤区域,影响其在损伤位点形成foci,且此作用依赖于KDM5B的去甲基化酶活性。但KDM5B对MDC1及gH2AX的IR后foci形成无影响;通过激光微束照射及免疫荧光实验,发现在DNA发生损伤时,KDM5B还能招募Ku70至损伤区域,此过程同样依赖于KDM5B的去甲基化酶活性;8)IR照射细胞或者加入NCS造成DNA双链损伤,发现KDM5B能影响损伤后检测点蛋白磷酸化水平;9)通过流式细胞术检测细胞周期,敲低KDM5B或者ATM并对细胞进行IR照射或者NCS处理,发现敲低KDM5B能增强细胞对基因毒性物质的敏感性;10)通过流式细胞术检测细胞周期,给予细胞IR照射或者转染siRNA等不同处理,发现KDM5B能影响细胞周期进程,敲低KDM5B能使细胞G1/S期过渡延迟,尤其是IR造成DNA损伤时,敲低KDM5B造成的对细胞周期的影响更加明显;11)通过在p53+/+细胞及p53-/-细胞内敲低KDM5B,Western blotting检测p53通路相关蛋白表达水平,发现KDM5B能影响p53+/+细胞中p53通路相关蛋白表达水平,但对于p53-/-细胞中p53通路蛋白无影响;而用流式细胞术检测细胞周期,发现KDM5B对细胞周期的影响只有在表达p53的细胞中存在,KDM5B对细胞周期的影响依赖于p53;结论:细胞经电离或内切酶处理后,KDM5B能富集在DNA损伤区域,这个过程是依赖于PARP1的。KDM5B是有效修复DNA双链损伤及招募Ku70与BRCA1的不可缺少的组分。KDM5B缺失能激活p53信号通路并使细胞对基因毒性损害更加敏感。此论文的结果证明KDM5B确实是一个DNA损伤反应蛋白,指出KDM5B是一个重要的基因守护者,是基因组稳定性的调节者。此论文使人们深入理解表观遗传调控对维持基因稳定的重要作用。