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MAPK(Mitogen-activated protein kinases)在多细胞生物个体发育、分化、细胞增殖、细胞存活和迁移、个体生长和细胞凋亡中扮演着重要的角色。以多倍体鲫鲤为材料,研究MAPK家族主要成员JNK和ERK在三倍体湘云鲫和四倍体鲫鲤不同发育时期胚胎和不同组织中的表达,进一步探讨MAPK信号通路在鱼类个体发育中的作用。
首先,我们根据已知的金鱼jnk1基因cDNA序列,克隆了三倍体湘云鲫与异源四倍体鲫鲤中jnk1基因cDNA全长。三倍体湘云鲫jnk1基因cDNA全长为1425bp,编码380个氨基酸;异源四倍体鲫鲤jnk1基因cDNA全长为1884bp,编码384个氨基酸。通过BioEdit7.0对金鱼、红鲫、湘江野鲤、改良四倍体鲫鲤、改良三倍体鲫鲤的jnk1基因进行同源性分析,三倍体湘云鲫jnk1基因氨基酸序列与金鱼、红鲫、湘江野鲤、四倍体鲫鲤的同源性分别为:97.9％、100％、98.1％、96.8％;四倍体鲫鲤jnk1基因氨基酸序列与金鱼、红鲫、湘江野鲤的同源性分别为:96.8％、96.8％、98.1％。三倍体湘云鲫jnk1基因与原始母本红鲫的同源性最高;四倍体鲫鲤jnk1基因则与原始父本湘江野鲤同源性最高。
运用RT-PCR技术和Western-blot检测了jnk1基因在多倍体鲫鲤中的mRNA和蛋白水平表达。结果显示,jnk1基因在多倍体鲫鲤组织和胚胎发育各个时期中均有表达。三倍体湘云鲫和异源四倍体鲫鲤卵裂期及囊胚中高JNK1 mRNA水平,表明母源性jnk1基因参与多倍体鱼早期胚胎发育调控。jnk1基因在三倍体湘云鲫和异源四倍体鲫鲤胚胎及成体组织中也表现出差异表达特征,在三倍体湘云鲫器官原基形成各个时期,JNK1蛋白表达水平相对较为恒定且有较高表达;而JNK1在异源四倍体鲫鲤器官原基形成各个时期的蛋白水平表达量则相对较低。利用Western-blot技术我们也检测了ERK在多倍体鲫鲤组织和胚胎发育各个时期的蛋白表达水平,研究发现ERE1/2在三倍体湘云鲫和四倍体鲫鲤胚胎眼色素时期及三倍体湘云鲫眼睛组织中有高量表达,推测ERK信号通路在鱼类眼睛的生长发育过程中起着重要作用。
最后检测了JNK1和ERK1/2在多倍体鲫鲤及其原始亲本性腺组织中的表达。结果显示JNK1与ERK1/2在红鲫、湘江野鲤、三倍体湘云鲫和异源四倍体鲫鲤的雌、雄性腺中均有表达,其中JNK1在红鲫雌、雄性腺中的表达模式与湘江野鲤雌、雄性腺比较一致,两者卵巢中的JNK1蛋白水平均高于精巢,P-JNK的表达模式与JNK的表达模式一致。然而JNK1在三倍体湘云鲫和异源四倍体鲫鲤卵巢中的JNK1蛋白水平均低于精巢,其P-JNK的表达模式与JNK1的表达模式一致。