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西瓜(Citrullus lanatus)是一种广泛栽培的园艺作物,大多为雌雄异花同株,具有很高的经济价值和营养价值。减数分裂作为有性生殖的主要过程,在减数分裂过程中由于非姐妹染色单体之间发生了交换,不仅增强了物种的遗传多样性,也为创制新的种质资源提供了更多的原材料,对西瓜的生殖发育至关重要。SPO11-1蛋白与拓扑异构酶VIA同源,能够起始减数分裂重组过程的发生。已有相关报道指出在拟南芥、水稻、玉米等植物中发现了SPO11-1的同源基因,它的突变会导致重组过程缺陷进而导致不育。本研究以拟南芥At SPO11-1基因的氨基酸序列在西瓜全基因组数据库中进行序列比对得到西瓜同源基因(ID:Cla003301),命名为Cl SPO11-1。克隆得到该基因后,通过农杆菌介导的转化方法对洋葱表皮进行瞬时转化表达。利用CRISPR/Cas9技术对目的基因进行敲除。通过酵母双杂交系统在西瓜混合c DNA文库中筛选Cl SPO11-1的互作蛋白。获得以下主要研究结果:1.从西瓜“97103”全基因组数据库BLAST得到Cl SPO11-1的基因和氨基酸序列,利用基因组网站得到的序列设计引物,从西瓜“YL”基因组DNA中克隆得到目的基因全长为3430bp,通过5’RACE PCR技术从“YL”花蕾中扩增得到目的基因的c DNA全长为1095bp,编码364个氨基酸,包含有15个外显子,14个内含子。2.进化树分析表明Cl SPO11-1在进化关系上与拟南芥较近,Cl SPO11-1蛋白包含TOPRIM＿Topo6A/Spo11保守结构域,属于拓扑异构酶基因家族成员,该蛋白属于疏水性蛋白,分子量为42.10 k Da,等电点为8.73。3.组织表达模式分析结果发现Cl SPO11-1基因在西瓜各个不同组织中均有表达,在花蕾(1.6-1.8mm)处于减数分裂偶线期时表达量最高;将构建好的p CAMBIA1300-Cl SPO11-1-GFP重组质粒导入农杆菌GV3101(p Soup-p19)细胞,并进一步进行洋葱表皮细胞的瞬时转化检测Cl SPO11-1亚细胞定位,结果显示该蛋白定位于细胞核内。4.将构建成功的Cl SPO11-1基因19nt双靶位CRISPR/Cas9基因编辑载体导入发根农杆菌Ar.Qual中,侵染西瓜子叶外植体,待其长出不定根后提取根系DNA,对靶位点进行PCR扩增,测序结果表明本试验其中1个靶位点出现被编辑现象,此结果表明该基因编辑载体可用于西瓜的稳定转化。5.,将上述构建且检测成功的Cl SPO11-1基因编辑载体稳定遗传转化西瓜,通过植物组织培养技术获得5株抗性植株,提取叶片的基因组DNA,进行PCR扩增检测,测序结果表明其中有2株植株在靶位点1处出现了不同程度的编辑现象。进一步对其氨基酸序列进行分析,结果表明2株抗性植株分别出现了氨基酸不同程度的变异或者翻译提前终止。6.构建Cl SPO11-1基因的酵母双杂交诱饵载体,将验证正确的酵母诱饵重组质粒p GBKT7-SPO11和p GBKT7空载体进行酵母菌株Y2HGold的转化,结果表明诱饵蛋白p GBKT7-SPO11无毒性和自激活作用。7.利用西瓜的混合c DNA文库,通过酵母双杂交系统筛选与Cl SPO11-1互作的蛋白。对筛选到的4个阳性克隆提取质粒并转化大肠杆菌感受态,PCR检测测序结果表明初步筛选获得4个单一序列,并在西瓜全基因组数据库中进行比对和注释。8.为了排除假阳性现象,通过酵母双杂交实验点对点检验Cl SPO11-1与4个候选互作蛋白之间的相互作用,结果发现Cl SPO11-1与其中的Cla014788和Cla008661两个蛋白发生互作,其编码的蛋白分别为激酶、酪氨酸磷酸酶。分析Cla014788和Cla008661基因在不同大小花蕾中的表达情况,结果发现Cla014788表达趋势为先降低再逐渐升高,Cla008661的表达趋势和Cl SPO11-1趋势相似,都是先升高再降低。结果表明,Cl SPO11-1与Cla008661基因具有一致的表达丰度曲线,提示我们,两者对应蛋白极有可能在西瓜体内是一对相互作用调控蛋白。