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桑叶（Mori Folium）为桑科（Moraceae）植物桑（Morus alba L.）的干燥叶,是疏散风热、清肺润燥、清肝明目的常用传统中药,也是卫生部规定的药食两用资源之一。桑叶自古以来就用于治疗糖尿病,《本草纲目》记载:“桑叶汁煎代茗,能止消渴”（即治疗糖尿病）;日本古书《吃茶养生记》中亦有记载:桑叶有改善“饮水病”的作用。现代研究表明桑叶中治疗糖尿病的主要活性成分是以1-脱氧野尻霉素（1-Deoxynojirimycin,DNJ）为主的多羟基类生物碱。由于桑叶中DNJ类多羟基生物碱的含量非常低,传统分离方法难以大量获得,因此亟待探索能够大量获得DNJ类多羟基生物碱的新方法。近年来,利用转录组学技术挖掘药用植物活性成分生物合成的关键酶基因,以合成生物学为基础大量获得天然活性成分成为一种重要的途径。本论文通过比较转录组学方法挖掘桑叶DNJ类多羟基生物碱生物合成关键酶基因,对其进行克隆、表达和功能验证,为进一步解析DNJ类多羟基生物碱生物合成途径及实现合成生物学生产奠定基础。并对桑叶经霜前后降血糖和润肺止咳作用进行研究,为指导桑叶功能性食品开发和临床合理应用提供依据。主要研究内容及创新性结果如下:1.桑叶不同生长期DNJ类多羟基生物碱动态变化规律研究采用柱前衍生化高效液相色谱法分析桑叶中DNJ生物碱在不同生长期动态变化规律,结果表明桑叶中DNJ含量在7、8月份最高,11月份最低。对2016年和2017年桑叶研究表明DNJ含量动态变化规律一致,2016年桑叶DNJ含量在7月31日最高为3.43±0.15 mg/g,在11月15日最低为0.19±0.05 mg/g,2017年桑叶DNJ含量在7月25日最高为3.22±0.06 mg/g,在11月15日最低为0.17±0.01 mg/g,该结果为桑叶转录组测序样本的选择提供依据。2.桑叶的转录组测序及比较转录组学分析采用Illumina HiSeq 2500对DNJ含量差异显著的桑叶样本进行转录组测序,获得16 Gb原始数据,分别获得105,189,326和65,166,690条原始序列,序列平均长度为150 bp。De Novo拼接得到112,481条转录本,平均长度为766bp。将拼接得到的转录本与九个公共数据库（CDD、KOG、NR、NT、PFAM、Swiss-Prot、TrEMBL、GO和KEGG）进行BLAST比对,共注释到89,606条序列。在COG/KOG数据库中比对,注释到20,725条序列,在GO数据库中有30,716条序列被注释到,在KEGG数据库中有13,268条序列被注释,参与323条代谢通路,与次生代谢相关的通路有131条,有157条基因涉及生物碱生物合成途径。通过分析共获得11,318条差异表达基因,其中6,606条基因表达上调,4,712条基因表达下调。KEGG代谢通路注释分析发现差异表达基因参与294条代谢通路,主要富集在碳代谢和氨基酸生物合成以及氧化磷酸化等途径,有15条差异表达基因涉及生物碱生物合成途径。3.桑叶DNJ类多羟基生物碱生物合成关键酶基因的挖掘根据转录组注释结果结合KEGG代谢通路,找到涉及DNJ类多羟基生物碱生物合成的赖氨酸合成通路（ko 00300）和哌啶环合成通路（ko 00960）,共涉及38条基因,编码9种酶,其中有9条差异表达基因,1条基因表达上调,8条基因表达下调。根据基因表达水平与DNJ含量相关性结果推测3条基因可能是DNJ类多羟基生物碱生物合成途径的关键酶基因,编码2种酶,分别是赖氨酸脱羧酶（Lysine decarboxylase）和伯胺氧化酶（Primary-amine oxidase）。通过对103条CYP450酶基因进行分析,发现差异表达基因有20条,其中11条基因表达上调,9条基因表达下调,有5条基因表达水平与DNJ含量呈显著相关。对110条甲基转移酶基因进行分析,发现差异表达基因共17条,其中8条表达上调,9表达条下调。4.桑叶赖氨酸脱羧酶和铜胺氧化酶基因的克隆、表达及功能验证首次从桑叶中克隆得到桑叶赖氨酸脱羧酶（Lysine Decarboxylase,MaLDC）基因（GeneBank登录号为:MG727866）和铜胺氧化酶（copper amine oxidase,MaCAO）基因的（Gene Bank登录号为:MH205733）ORF全长序列。生物信息学分析结果表明,MaLDC含有赖氨酸家族的保守结构域PGGXGTXXE,MaCAO包含一个铜胺氧化酶结构域,属于Cuamineoxid亚家族;蛋白三级结构预测结果表明,Ma LDC蛋白与赖氨酸脱羧酶（PDB ID:2Q4D）相似度为69.12%,MaCAO蛋白与铜胺氧化酶（PDB ID:1W2Z）相似度为45.52%。采用双酶切法分别构建pET28a（+）/MaLDC和pET-22b（+）/MaCAO重组表达载体,并转化到大肠杆菌BL21（DE3）表达重组蛋白。采用体外酶促反应验证重组蛋白的功能,结果表明Ma LDC重组蛋白能够有效催化赖氨酸脱羧产生尸胺,对底物赖氨酸的Km值和Vmax值分别为19.18mmol/L和3.31 mmol/min,表明Ma LDC具有较高的底物特异性及酶活力。MaCAO重组蛋白的功能验证结果表明该蛋白能催化1,5戊二胺形成5-氨基戊醛。Ma LDC基因表达水平和酶活以及MaCAO基因表达水平均与桑叶DNJ含量显著正相关,表明MaLDC和MaCAO可能是DNJ类多羟基生物碱合成的关键酶基因。5.桑叶经霜前后降血糖及润肺止咳作用初步研究首次对未经霜桑叶（8月份）和霜桑叶（11月份）的降血糖和润肺止咳作用进行研究。采用糖尿病小鼠模型研究桑叶降血糖作用,结果显示未经霜桑叶可以显著降低糖尿病小鼠的空腹血糖值,增加肝糖原的合成量,显著降低糖尿病小鼠血清谷丙转氨酶（ALT）和丙二醛（MDA）水平,病理组织切片分析结果显示未经霜桑叶对肝脏和胰腺的损伤有一定的保护和修复作用,表明未经霜桑叶的降血糖作用优于霜桑叶。采用小鼠氨水刺激引咳、豚鼠电刺激引咳、大鼠气管毛细管排痰、小鼠气道酚红排泄及糖尿病小鼠等现代药理模型和实验方法研究桑叶润肺止咳作用,结果显示霜桑叶对浓氨水引发的小鼠咳嗽、电刺激引起的豚鼠咳嗽有显著的抑制作用,霜桑叶可以显著促进大鼠4小时内的排痰量和小鼠气道酚红的分泌量,结果表明霜桑叶的镇咳、祛痰作用优于未经霜桑叶。本章结果为指导桑叶功能性食品开发及临床合理用药提供依据。