研究背景和目的结直肠癌是消化系统常见恶性肿瘤之一。近年来,随着人们生活方式及饮食结构的转变,结直肠癌的发病率在世界范围内呈上升趋势。其发病率和肿瘤相关死亡率位居所有肿瘤前三位,且发病年龄趋于年轻化。转移是引起结直肠癌患者死亡的首要原因,在初次诊断和临床治疗过程中,约40-50%的患者可检测到转移灶。淋巴结转移是结直肠癌转移的主要方式之一,肝脏是结肠癌转移的主要靶器官,结直肠癌死亡的患者肝转移率高达45%～71%。因此,加强对结直肠癌发病及转移机制的基础研究,发现和鉴定出具有高度特异性和敏感性的结肠癌分子标志物,从而提供结直肠癌发生预警及预后判断的新靶点,对于改善结直肠癌预后具有重要意义。氧化还原态（redox status）平衡是维持机体内环境稳定的基本要素之一,越来越多的研究证实,肿瘤细胞内部氧化还原态失衡与肿瘤密切相关。在肿瘤的发生和演进过程中,由于肿瘤细胞能量需求增高、生长过程中的间歇性缺氧以及伴随的感染、炎症等,导致肿瘤微环境中活性氧簇ROS（reactive oxygen species,ROS）急剧增加,从而造成氧化应激,影响细胞代谢通路与信号转导途径,进而造成肿瘤的生物学行为发生改变。基于上述提示,通过调节细胞内氧化还原状态可能会影响肿瘤的转移。过氧化氧化还原蛋白1（peroxiredoxins1,PRDX1）是新近发现的一种重要的细胞内抗氧化蛋白,PRDX1基因定位于人染色体1p34.1上,长度为15Kb,有四个转录子,都编码PRDX1蛋白。PRDX1参与细胞的氧化还原调节,主要通过硫氧还蛋白系统而不是通过谷氧还蛋白来降低过氧化物和还原当量,可能在减少过氧化物产生的新陈代谢过程中发挥重要作用。PRDX1可以通过硫氧还蛋白还原、清除过氧化物或超氧化物,在对抗ROS、细胞抗氧化防御过程中发挥关键作用,也可能通过调节细胞内H202的聚积来参与生长因子和肿瘤坏死因子的信号级联放大。研究表明,PRDX1作为细胞内有害活性氧的清除剂,对于肿瘤细胞具有双重作用:一方面,PRDX1可阻碍正常细胞因活性氧导致DNA等损伤而向恶性转化,抑制肿瘤的发生;另一方面,PRDX1也可抑制已转化的肿瘤细胞内大量活性氧诱导的凋亡,促进肿瘤细胞的存活,起到肿瘤支持与保护作用。此外,PRDX1也可通过其他途径在肿瘤细胞增殖和演进等方面也发挥重要作用。据已有研究显示,在不同肿瘤的演进过程中,PRDX1的作用机理不尽相同,尚缺乏清晰明了的认识,得出的结论也差异较大,因此对其进一步的深入研究非常必要,也是近年来研究的热点。目前,PRDX1在结直肠癌中的相关研究较少,且仅限于组织学的粗浅鉴定,其中与结直肠癌转移的相关性研究更是未见报道。以PRDX1为靶点探索氧化还原态失衡与结直肠癌转移的相关性有望成为一个新的研究方向,阐明其调控机制将为结直肠癌转移的预防、治疗提供新的思路和新靶标。研究方法1.收集结直肠正常组织-增生性息肉-管状腺瘤-中-重度不典型增生-腺癌-腺癌淋巴结转移灶各个发展阶段的石蜡标本各30例,一步法进行免疫组织化学（IHC）检测PRDX1的表达情况;分析PRDX1的表达与结直肠癌发生及演进过程的相关性。收集新鲜结直肠癌及配对周围正常组织24对分别进行荧光实时定量PCR（Real-Time quantitative PCR）及免疫印迹（Western Blot）检测组织中PRDX1的表达情况,2.建立PRDX1稳定过表达和干扰的结直肠癌细胞株SW620-PRDX1和SW480-shRNAi-PRDX1,通过 MTT、平板克隆、Transwell、划痕实验检测 PRDX1对细胞的增殖、运动迁移能力的影响;利用裸鼠皮下成瘤实验,体内水平检测PRDX1对结直肠癌细胞株增殖的影响;透射电镜技术观察PRDX1稳定过表达和干扰后结直肠癌细胞内细胞器的改变。3.应用不同浓度（0,20,40,60,80,100,120μM）的H₂O₂作用于结直肠癌细胞株SW480和SW620细胞24h,通过MTT法筛选出最佳H202浓度;再以此浓度作用于SW480、SW620细胞不同时间（30min,3h,6h,12h,24h,48h）,MTT法选出最适H₂O₂作用时间,以此构建结直肠癌细胞氧化应激模型,通过流式细胞检测细胞的凋亡和周期分布,观察PRDX1对氧化应激的作用。4.利用基因芯片技术检测PRDX1干扰前后结直肠癌中相关基因谱的变化,阐明PRDX1在结直肠转移及耐药性中的信号调控网络;应用CO-IP、Western Blot验证部分差异基因及信号通路。5.统计学方法运用SPSS17.0统计学软件进行统计学分析。卡方检验检测PRDX1表达与结直肠癌发生及演进不同阶段之间的相关性;MTT实验采用析因设计的方差分析;实时定量PCR、平板克隆、裸鼠皮下成瘤、Transwell侵袭实验采用两独立样本的t检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果1.结直肠癌组织中PRDX1的表达1.1免疫组织化学结果显示PRDX1阳性表达主要定位于细胞质,分为阴性、淡黄色、黄色、深黄色、黄褐色四种颜色,得分分别记为0、1、2、3、4。阳性细胞数分为<5%、5-25%、26-50%、56-75%、76-100%五个阶段,得分分别记为0、1、2、3、4,相乘即为总得分。统计:PRDX1的表达与结直肠癌不同发展阶段呈现动态表达趋势,在结直肠癌发生发展的前期阶段,PRDX1表达呈逐级递增趋势,差异有统计学意义（F=58.054,P<0.001）;但是在淋巴结转移灶中,PRDX1表达并未持续增高,部分病例甚至出现表达水平降低,差异有统计学意义（P<0.001）。1.2 RT-qPCR及Western blot结果显示结直肠癌肿瘤组织中PRDX1 mRNA和蛋白的表达均高于相配对的正常结直肠组织,差异具有统计学意义（P<0.001）。2.PRDX1对结直肠癌细胞生物学行为产生的影响。2.1 RT-qPCR及Western blot检测9株结直肠癌细胞株SW480、SW620、HT29、HCT15、HCT116、LOVO、LS-174T、DLD-1、M5 中 PRDX1mRNA 及蛋白的表达,结果显示PRDX1在SW480中高表达,在SW620中表达较低,差异有统计学意义（P<0.05）,Western blot与RT-qPCR结果一致。2.2应用分子克隆技术构建了 PRDX1过表达和干扰的慢病毒表达载体,测序结果显示插入序列正确。利用慢病毒载体构建了稳定过表达PRDX1的SW620细胞株SW620-PRDX1和稳定干扰 PRDX1 的 SW480 细胞株 SW480-shRNAi-PRDX1,经RT-qPCR及Western blot验证PRDX1过表达及干扰效果显著,差异具有统计学意义（P<0.001）。2.3MTT实验结果显示,与对照组相比,过表达PRDX1后SW620细胞株SW620-PRDX1生长速度减慢,差异具有统计学意义（P<0.001）;而干扰PRDX1后SW480细胞株SW480-shRNAi-PRDX1生长速度加快,差异具有统计学意义（P<0.001）.。2.4平板克隆实验结果显示,过表达PRDX1后SW620-PRDX1细胞株的克隆形成数为20±6.689个,而SW620-Vector克隆形成数为34±14.850个,差异具有统计学意义（P<0.05）;此外,干扰PRDX1后SW480-shRNAi-PRDX1细胞株克隆形成数为63±10.185个,而SW480-shRNAi-NC克隆形成数为27±7.806个,差异具有统计学意义（P<0.001）。2.5裸鼠皮下成瘤实验结果表明,与对照组相比,PRDX1过表达组裸鼠皮下瘤生长速度较慢,肿瘤体积较小（P<0.05）;而PRDX1干扰组肿瘤生长速度较快,肿瘤体积较大（P<0.05）;并且PRDX1过表达组的Ki67阳性率（31.2±6.301）显著低于对照组（69.6±9.787）（P<0.05）,而 PRDX1 干扰组的Ki67 阳性率（42.2±11.882）显著高于对照组（22.2±6.496）（P<0.05）。2.6 Transwell小室运动迁移实验结果显示,细胞接种小室后培养24h,过表达PRDX1的SW620-PRDX1细胞株迁移细胞数量为73.6±24.453,而SW620-Vector迁移细胞数为120±24.453,细胞迁移数量明显减少（P<0.001）,而PRDX1干扰后SW480细胞株SW480-shRNAi-PRDX1细胞迁移数量为71.6±29.497,与对照组迁移细胞数26.3±9.036相比,差异具有统计学意义（P<0.001）。2.7划痕实验结果显示,与对照组相比过表达PRDX1的SW620-PRDX1细胞株运动速度显著减慢;反之,PRDX1干扰细胞株SW480-shRNAi-PRDX1细胞运动速度则明显快于对照组。2.8透射电镜结果显示,与对照组相比,过表达PRDX1的SW620-PRDX1细胞线粒体肿胀明显改善;而PRDX1干扰细胞株SW480-shRNAi-PRDX1细胞线粒体肿胀明显。2.9 H202氧化应激模型MTT检测结果显示,SW620、SW480细胞分别在H₂O₂浓度为80μM/L、100μM/L时,H202作用时间分别为18h、24h时增殖效率下降显著。应用以上浓度和时间点构建H202氧化应激模型,流式细胞仪检测细胞周期结果显示:与对照组相比,过表达PRDX1后的SW620-PRDX1细胞及H202刺激后SW620-PRDX1细胞G1期细胞百分率分别增高了 11%和17%,而S,G2/M期细胞百分率下降明显,差异具有统计学意义（P<0.001）;而干扰PRDX1后的 SW480-PRDX1-shRNAi 细胞和 H₂O₂刺激后的 SW480-shRNAi-PRDX1 细胞G1期细胞百分率分别下降了 16%和15%,而S,G2/M期细胞百分率增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。综合上述结果提示,PRDX1在普通培养条件及H202刺激条件下均能引起细胞周期的G1期阻滞抑制肿瘤细胞的增殖。同样以流式细胞仪检测上述细胞模型凋亡分布,结果显示:PRDX1主要影响结直肠癌细胞株SW620和SW480的早期凋亡（Q4期）,而对晚期凋亡影响不明显（Q2期）,与对照组相比,SW620-PRDX1细胞株凋亡细胞百分比无明显变化,但在H202刺激时,PRDX1过表达组细胞凋亡百分比24.767±1.172明显大于对照组7.967±0.462,差异具有统计学意义（P<0.001）;干扰PRDX1的SW480细胞株凋亡发生不明显,但与对照组相比凋亡细胞略低,差异仍具有统计意（P<0.05）;H202刺激以后,干扰PRDX1的SW480细胞株凋亡细胞比例6.167±0.35明显低于对照组18.607±0.757,差异具有统计学意义（P<0.05）。3.基因芯片结果显示,直肠癌细胞株SW480稳定干扰PRDX1后,发现FC（Foldchange）>1.5,p<0.05的差异基因有1096个,与对照组相比,上调基因452个,下调基因644个;检索数据库KEGG与BIOCARTA中所有pathway的基因信息,将差异基因进行富集分析并根据P值排序,排名前十位的相关通路主要有:肿瘤相关通路（Pathway in cancer）、肌动蛋白细胞骨架通路（Regulation of actin cytoskeleton）、细胞侵袭及迁移（Leukocyte transedothelial magratration）、细胞周期（Cell cycle）、细胞黏附（Focal adhesion）、卵母细胞成熟相关通路（Oocyte meiosis）等通路;选择相关性最大的Pathway in cancer通路中BIRC5、FN1、FOS、MAPK9四个差异基因进行Western blot进一步验证,发现BIRC5、FOS、MAPK9三个蛋白表达与基因芯片结果一致,提示基因芯片结果可靠。4.CO-IP及Western blot结果显示MAPK9与PRDX1可能存在相互结合并激活MAPK相关信号通路,进而影响结直肠癌的进展。结论:1.在结直肠癌的发生与演进过程中,PRDX1的表达与其呈正相关;而在结直肠癌发展后期,尤其是转移阶段,PRDX1的表达趋势发生改变甚至逆转。2.过表达PRDX1可以抑制结直肠癌的增殖和运动迁移能力;干扰PRDX1后,结直肠癌的增殖和运动迁移能力增强;3.PRDX1可以通过发挥其抗氧化保护作用来抑制肿瘤细胞的发生及演进过程。4.PRDX1参与多个肿瘤相关信号传导通路,并能够通过与MAPK9结合激活MAPK信号通路进而在结肠癌演进过程中发挥重要作用。