研究目的:骨植入体植入失败是目前临床亟待解决的问题。前期研究显示锌钙摩尔比为0.5的锌修饰硅酸钙(Ca2ZnSi2O7)陶瓷涂层比硅酸钙(CaSiO3)陶瓷涂层具有更好的促前成骨细胞粘附、增殖及分化的作用,并能与宿主骨界面形成有效的整合,揭示经过Zn离子修饰的CaSiO3陶瓷涂层对前成骨细胞生物学效应产生重要作用。骨髓间充质干细胞(BMSCs)作为体内成骨细胞的主要分化来源,探索出对于BMSCs具有最理想生物学活性锌钙摩尔比的Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层,并研究其浸提液对BMSCs的生物学影响及作用机制显得尤为重要,为进一步探讨其作为骨植入体涂层运用于大体实验以及骨科和牙科临床奠定实验基础。研究内容:(1)BMSCs的提取、纯化和鉴定。使用全骨髓贴壁法提取SD大鼠BMSCs,培养至第三代后,使用流式细胞术检测CD29、CD90、CD45、CD31阳性率,进行成骨成脂诱导分化后,分别行茜素红和油红O染色后观察分化情况,使用免疫荧光染色法进行Vimentin染色后观察染色情况。(2)构建并优化Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层。采用溶胶-凝胶法并调节锌钙离子的摩尔比,构建锌钙摩尔比分别为0.1、0.3、0.5的Ca2ZnSi2O7陶瓷粉体,然后使用大气等离子喷涂系统(APS)进行喷涂,在特定参数下获得Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层,检测涂层表面形貌、化学稳定性及与钛基底材料的结合强度等。(3)观察不同锌钙摩尔比的Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层对BMSC的生物学影响。检测涂层浸提液中的钙(Ca)、硅(Si)、锌(Zn)离子浓度。通过CCK-8试剂盒检测、倒置显微镜观察BMSC在涂层材料表面及其浸提液中培养后的粘附、增殖情况;通过ELISA方法检测BMSCs在涂层材料表面及其浸提液中添加成骨诱导剂培养后ALP、BGP、COL-I的生成情况,茜素红染色观察钙结节形成情况,ALP染色观察ALP分泌情况。探索出促BMSCs生物学活性最优的锌钙摩尔比Ca2ZnSi2O7陶瓷。(4)TGF-β1及IGF-1所介导的TGF-β/Smad、MAPK/ERK及PKC信号转导通路研究。使用最适锌钙摩尔比的Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层作为实验组,BMSCs在含成骨诱导剂的各组浸提液中培养后,采用qRT-PCR方法检测成骨标记基因ALP、BGP、COL-I,TGF-β/Smad信号通路中TGF-β1、Smad2、Smad3,以及MAPK/ERK、PKC信号通路中的IGF-I、ERK1、REK2、PKC-δ等关键基因mRNA的表达情况。探索TGF-β/Smad及MAPK及PKC信号转导通路在Ca2ZnSi2O7陶瓷涂层对BMSCs生物学影响的作用。结果:(一)使用全骨髓贴壁法成功传代培养出了数量较多、细胞纯度较高的sd大鼠bmscs,具有良好的分化潜能。(二)成功制备了锌钙摩尔比为0.1、0.3、0.5的ca2znsi2o7陶瓷涂层,各组涂层的表面形貌均较为粗糙,与钛基的结合强度均明显强于casio3陶瓷涂层,三组之间未见明显区别;各组材料在dmem/f12培养液中浸泡1d后,casio3涂层释放ca、si离子浓度最高,而zn离子浓度同普通培养基一致,ca2znsi2o7陶瓷涂层ca、si离子浓度随着锌钙摩尔比的增加而减少,同时zn离子浓度随之增加。(三)bmscs在三组ca2znsi2o7陶瓷涂层表面及浸提液中粘附和增殖情况均显著优于未涂层钛合金金属片及casio3陶瓷涂层,其中锌钙摩尔比为0.3的ca2znsi2o7陶瓷涂层显著优于其余两组;在添加成骨诱导剂的条件下,bmscs在三组ca2znsi2o7陶瓷涂层表面及浸提液中培养后,成骨分化及生成alp、col-i、bgp以及钙结节形成情况均显著优于未涂层钛片及casio3陶瓷涂层,其中锌钙摩尔比为0.3的ca2znsi2o7陶瓷涂层显著优于其余两组。(四)bmscs在各组含成骨诱导剂的浸提液中培养后,alp、bgp、col-imrna的表达量以及tgf-β1、smad2、smad3mrna的表达量均随时间变化而升高,锌钙摩尔比为0.3的ca2znsi2o7陶瓷涂层的表达量最高,casio3组次之。igf-i、erk1、erk2、pkc-δmrna的表达量随时间延长而轻度升高,组间无明显差异,21d时igf-imrna的表达量在锌钙摩尔比为0.3的ca2znsi2o7陶瓷涂层浸提液中显著增多。结论:不同锌钙摩尔比的ca2znsi2o7陶瓷涂层都具有粗糙的表面形貌、丰富的孔隙和生物活性的化学组分,并可释放出的生物活性离子,无论是bmscs在其表面直接培养,还是使用其浸提液进行培养,均表现出了相对于未涂层纯钛金属片和casio3陶瓷涂层更为优秀的促bmscs粘附、增殖及成骨分化和矿化的能力。其中锌钙摩尔比为0.3的ca2znsi2o7陶瓷涂层对bmscs的生物学影响最为积极。因此,该涂层对bmscs拥有更加优越的生物相容性和生物活性,显著促进其粘附、增殖及成骨分化,所释放出浓度适宜的zn离子起了至关重要的作用,并且化学稳定性好,与钛基结合强度较高,再加上优秀的抗菌性能,该材料作为新型的骨植入体材料拥有良好的前景。ca2znsi2o7陶瓷涂层促进bmscs成骨分化的过程可能通过tgf-β/smad信号通路传导,而mapk/erk、pkc信号通路在bmscs成骨过程中未被激活。igf-i在bmscs成骨分化晚期可能也起了作用。