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第一部分糖尿病合并侵袭性曲霉病小鼠模型的构建目的:创建在糖尿病基础上发生侵袭性曲霉病的小鼠模型,评估糖尿病小鼠对侵袭性曲霉病的易感性。方法:C57BL/6小鼠被用作模型动物,通过喂饲高脂饮食(HFD)和注射链脲佐菌素(STZ)来诱导形成2型糖尿病(T2DM)。设对照组和糖尿病组,经气道接种烟曲霉来诱导侵袭性曲霉病,在不同时间点检测肺组织的真菌负荷、炎症因子、组织病理和多个部位的中性粒细胞计数。结果:成功创建了T2DM和侵袭性曲霉病的小鼠模型。在接种后所有时间点,糖尿病组的真菌负荷均高于对照组,在72小时及以后有显著性差异(P<0.05)。在接种前和接种后,糖尿病组循环血和支气管肺泡灌洗液(BALF)内中性粒细胞的计数更高,两组之间的差异均有统计学意义(P<0.05)。接种后48小时,糖尿病组的肺组织中髓过氧化物酶(MPO)含量显著高于对照组(P<0.05)。接种后72小时,糖尿病组的肺部炎症病变更严重。接种后24小时和72小时,糖尿病组肺部IL-1β和TNF-α的水平均高于对照组,IL-1β差异在接种后24小时有统计学意义(P<0.05),TNF-α的差异在接种后72小时有统计学意义(P<0.05)。结论:经气道给T2DM小鼠同时接种烟曲霉孢子和菌丝能够创建发生侵袭性曲霉病的小鼠模型。T2DM小鼠对侵袭性曲霉病易感性增高,其易感性的增高可能与中性粒细胞功能异常有关。第二部分中性粒细胞细胞内和细胞外活性氧在2型糖尿病小鼠侵袭性曲霉病中的不同作用目的:T2DM小鼠对侵袭性曲霉病易感的机制不清,T2DM影响中性粒细胞活性氧(ROS)的产生可能与易感性增加有关。方法:利用发生侵袭性曲霉病的糖尿病小鼠与对照小鼠,比较两组小鼠肺组织中中性粒细胞产生的ROS和细胞外诱捕器(NETs)水平。在体外将中性粒细胞与菌丝共同孵育,观察比较两组中性粒细胞的杀菌活性、活力、凋亡,以及ROS、炎症因子和中性粒细胞细胞外诱捕器(NETs)水平。结果:烟曲霉感染后48小时,在糖尿病组肺组织中检测到的ROS和NETs均超过对照组,在统计学上存在明显差别(P<0.05)。在体外与菌丝共同孵育后,糖尿病组中性粒细胞杀菌活性较对照组降低,48小时后在统计学上存在明显差别(P<0.05)。共同孵育6小时,糖尿病小鼠中性粒细胞的细胞内ROS和NETs均超过对照小鼠(P<0.05),细胞外ROS少于对照小鼠(P<0.05)。共同孵育24小时,糖尿病组中性粒细胞活力较对照组低,IL-1β和TNF-α的表达高于对照组(P<0.05)。共同孵育48小时,糖尿病组中性粒细胞的凋亡率高于对照组(P<0.05)结论:中性粒细胞ROS生成异常同T2DM小鼠对侵袭性曲霉病易感有关,细胞外ROS减少导致杀菌活性降低,细胞内ROS增多引起自身和组织损伤。第三部分烟曲霉感染时T2DM小鼠中性粒细胞经ERK1/2-NOX2通路调控细胞内活性氧目的:烟曲霉感染时糖尿病小鼠中性粒细胞ROS生成异常的机制目前尚不清楚,推测可能与ERK1/2异常激活NOX2有关。方法:将取自糖尿病小鼠和正常小鼠的中性粒细胞分别设为糖尿病组和对照组。在体外将两组分别与烟曲霉菌丝共孵育,比较孵育前后两组NOX2亚基(p47phox和gp91phox)和ERK的表达或磷酸化的差异。用PD98059阻断ERK1/2通路,观察两组p47phox和gp91phox表达或磷酸化的变化,比较两组间的差异。比较干预前后两组细胞内和细胞外ROS、细胞因子、胞外诱捕器(NETs)以及杀菌活性的差异。结果:糖尿病组gp91phox的表达高于对照组(p<0.05),p47phox和ERK的磷酸化程度都超过对照组(p<0.05)。ERK1/2被抑制后,每组gp91phox的表达与p47phox和ERK的磷酸化均明显降低(p<0.05)。ERK1/2被抑制后,对照组细胞内ROS的降低接近于存在显著性(p=0.056),糖尿病组细胞内ROS的降低存在显著性(p<0.05);两组细胞外ROS的降低均不明显(p>0.05);两组Sytox Green和H3阳性率、IL-1β和TNF-α水平的降低都存在显著性(p<0.05);两组对菌丝活力的影响都不明显(p>0.05)。结论:烟曲霉经ERK1/2激活小鼠中性粒细胞NOX2,糖尿病小鼠ERK1/2的过度活化使gp91phox表达和p47phox磷酸化异常增加导致细胞内ROS产生异常。干扰ERK1/2通路降低了糖尿病小鼠中性粒细胞细胞内ROS和促炎症反应,尽管没有改善中性粒细胞的杀菌活性,但可能减轻炎症损伤。