LKB1,也称为丝氨酸/苏氨酸激酶11(STK11),最早在Peutz-Jeghers综合征(PJS)中被鉴定失活突变。LKB1常与假激酶STRAD和支架蛋白M025形成复合物,以调节自身蛋白稳定性、激酶活性和亚细胞定位。LKB1可直接磷酸化AMPK和其他12种AMPK样激酶,参与调控细胞的生长、代谢、自噬和极性。大量研究表明LKB1为抑癌基因,其失活突变与多种肿瘤中发生发展相关,如肺癌、皮肤癌等。虽然人们研究表明LKB1在结直肠癌中的突变较低,但其低表达与结直肠癌患者不良预后相关。为研究LKB1在结直肠癌中的作用,首先我们利用Cas9技术构建稳定敲除LKB1的结直肠癌细胞株。利用CCK-8实验研究LKB1对结直肠癌细胞增殖的影响,结果发现LKB1的敲除对结直肠癌细胞增殖的影响不显著。我们用AOM/DSS诱导LKB1肠道条件敲除小鼠的结直肠形成肿瘤,发现LKB1条件性敲除小鼠肠道肿瘤数目和对照小鼠的结直肠肿瘤数目无明显差异。通过细胞的迁移和侵袭实验,我们发现LKB1的敲除促进结直肠癌细胞的迁移和侵袭。通过小鼠尾静脉肺转移实验,发现LKB1的敲除促进结直肠癌细胞的肺转移。为了探讨LKB1的敲除如何促进结直肠癌细胞迁移和侵袭,我们使用RNA-seq测序,分别分析HCT116和HCT15两株细胞在LKB1敲除前后基因的差异表达情况。结果发现在两组细胞中有44个共同的差异表达基因,其中包括与结直肠癌相关的基因TNIK。为了探讨LKB1与TNIK间的调控关系,我们首先通过在结直肠癌细胞中敲除和过表达LKB1,发现LKB1能够负调控TNIK的表达;且LKB1激酶失活突变不能有效抑制TNIK的表达,表明LKB1负调控TNIK的表达依赖其激酶活性。为了明确TNIK对结直肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响,我们首先构建稳定敲降TNIK的细胞。迁移和侵袭实验表明,敲降TNIK可以抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭。为了探究LKB1是否通过调控TNIK的表达影响结直肠癌细胞迁移和侵袭能力,我们在LKB1敲除的HCT116结直肠癌细胞中敲降TNIK的表达,体内外实验结果表明LKB1的敲除促进结直肠癌细胞的迁移、侵袭以及小鼠体内的肺转移部分依赖于TNIK的表达。为了进一步探讨TNIK影响结直肠癌细胞迁移和侵袭的机制,我们利用质谱分析了与TNIK作用的蛋白,结果发现TNIK可与细胞骨架相关蛋白ARHGAP29相互作用。有文章表明ARHAGP29可以抑制RhoA的活性,进而抑制促肌动蛋白解聚因子cofilin的磷酸化,使其发挥对肌动蛋白的解聚活性,最终加速细胞肌动蛋白骨架的重塑过程。我们在结直肠癌细胞中过表达TNIK或者缺失LKB1,结果发现cofilin的磷酸化水平都下降。此外,我们还使用免疫荧光检测肌动蛋白形成的伪足,结果发现在结直肠癌细胞中过表达TNIK或者缺失LKB1其细胞周围的伪足都明显增多。以上结果提示TNIK对细胞微丝骨架重塑可能在LKB1影响结直肠癌细胞的迁移和侵袭过程中起一定作用。此外,我们还初步探讨了 LKB1对肿瘤微环境中巨噬细胞的影响,肿瘤微环境中的巨噬细胞通常被分为两种极化形式,即抗肿瘤的M1型和促肿瘤的M2型。我们使用LKB1敲除的结直肠癌细胞条件培养基刺激巨噬细胞,通过Q-PCR和免疫荧光染色方法检测M1和M2的相关分子的表达,结果发现LKB1敲除的结直肠癌细胞条件培养基可诱导巨噬细胞的极性偏向于M2型的状态。综上,我们的研究结果表明,LKB1的敲除对结直肠癌细胞增殖的影响不显著,但其对结直肠癌细胞的转移能力显著增强。LKB1的敲除增强结直肠癌细胞的转移能力部分依赖于TNIK的表达和TNIK影响的细胞骨架重塑。本研究通过揭示LKB1的敲除增强结直肠癌细胞转移能力的可能机制,为结直肠癌的治疗提供新思路。此外,通过初步研究LKB1敲除的结直肠癌细胞条件培养基对巨噬细胞极性的影响,丰富了 LKB1在结直肠癌中的作用。基因的选择性剪接是pre-mRNA加工过程中选择性的包含或删除不同外显子和内含子,该过程可产生不同成熟的mRNA,极大丰富了基因转录组和蛋白组的多样性,据估计人类中高达94%的基因可发生选择性剪接。基因的选择性剪接参与组织特异性的形成和正常发育调控等正常生命活动。基因选择性剪接异常与人类多种疾病相关,包括肿瘤。基因的选择性剪接异常与肿瘤的发生发展密切相关,其剪接异构体也可作为肿瘤分子标记物和治疗的靶点。基因的选择性剪接异常参与肿瘤的发生发展是多方面的,包括细胞增殖、细胞凋亡、肿瘤细胞的代谢、血管生成及肿瘤转移。目前基因剪接异常在多种肿瘤中被相继报道和研究,然而其在肝细胞癌中的研究还不是很多。为了研究肝癌中基因的剪接异常,我们使用HTA2.0基因芯片,分析术后2年内复发和未复发肝癌患者的肝癌组织样本各5例中基因选择性剪接差异,发现细胞周期相关的CHK1基因的差异剪接。CHK1是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,调节DNA损伤反应。在本研究中,我们检测了肝细胞癌(HCC)组织中选择性剪接体CHK1-S(3号外显子缺失)的mRNA水平。我们的结果显示,与配对的癌旁组织相比,CHK1-S在HCC组织中显著高表达。CHK1-S的高剪接率与术后HCC患者的无复发生存期(RFS)密切相关。为了进一步探究CHK1-S在HCC中的作用,我们使用CCK-8实验、EdU掺入实验和集落形成实验。结果显示,与正常CHK1(CHK1-L)相比,CHK1-S的过表达显著促进肝癌细胞的增殖。为了探讨CHK1-S的剪接机制,我们分析前面基因芯片数据中与剪接相关的基因,发现了可调控剪接因子活性的剪接因子激酶SRPK1存在表达差异,在肝癌组织中进一步验证其mRNA水平和蛋白水平,发现SRPK1在肝癌组织中的表达水平都显著高于其配对的癌旁组织,并且SRPK1的mRNA 水平与CHK1-S的水平正相关(P=0.016)。当我们HepG2和QSG-7701细胞中过表达SRPK1,发现可使CHK1-S的蛋白水平升高,这表明SRPK1参与调控CHK1-S剪接异构体的形成。总之,我们的研究表明,CHK1-S在肝癌中发挥癌基因的作用,其表达水平表达与RFS相关;SRPK1可介导CHK1-S在肝癌中的剪接。我们的研究结果提示表明CHK1-S的表达在HCC预后评估中具有潜在的应用价值,且剪接因子激酶SRPK1可作为潜在的治疗靶点。