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甘蓝是十字花科芸薹属绿叶蔬菜,在世界各国有着广泛的种植,也是我国种植较多的蔬菜作物之一,在我国蔬菜周年均衡供应上有着不可替代的地位。甘蓝是典型的异花授粉作物,具有明显的杂种优势,杂种一代品种选育是甘蓝育种的主要途径。甘蓝属于典型的二年生作物,具有自交不亲和的特性,开花需要通过严格的低温春化,使用传统方法培育杂种一代纯合自交系耗时费力占空间,所以研发快速便捷精准可靠的甘蓝育种新技术迫在眉睫。单倍体诱导系已经在多种农作物中被发现或创制,因此,在甘蓝中开发单倍体诱导系对推动甘蓝杂种一代品种选育具有重要的价值。着丝粒组蛋白CENH3基因的突变在多种植物中被证明具有单倍体诱导能力,因此,针对甘蓝中CENH3基因,利用能够实现特定碱基任意变换的Prime editing（PE）编辑器进行特定氨基酸的突变将有可能直接获得甘蓝的单倍体诱导系,从而推动甘蓝自交系的快速选育。本研究中,使用根据植物密码子优化的n Cas9（H840A）和经过甘蓝密码子优化的莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶五重突变体MLV构建PE编辑器。并将其导入到烟草和甘蓝,验证其编辑能力和编辑效率。另外针对再生植株为嵌合体的问题,设计了PE编辑的富集系统,研究是否能够提高编辑效率。据此,做了如下试验:1、在烟草中验证PE编辑系统的编辑能力和编辑效率。首先将外源MYB基因提前做无义突变,将其插入到p BI525中间载体表达盒中,再将表达盒装载到p CAMBIA2300载体构建出p CA2300-MYB（TAG）编辑指示载体。然后根据无义突变位点设计peg RNA和g RNA,将其装载到PE编辑载体上,构建出PE-MYB靶向编辑载体。通过农杆菌介导将p CA2300-MYB（TAG）和PE-MYB共同转入烟草叶片中,经过Kan和PPT的双重筛选,最终获得了75个愈伤组织,其中一个愈伤有紫红色斑点,所以PE编辑器在烟草中对MYB基因的编辑效率为1.3%（1/75）。为进一步确定编辑结果的可靠性,将紫红色愈伤继代培养,共获得了11株再生植株,其中10株只含有紫红色斑点叶片,1株含有完整的紫红色叶片。使用CTAB法提取11株再生植株的DNA,并克隆MYB基因进行sanger测序分析,发现10株含有紫红色斑点的植株均为检测到突变,而拥有完整紫红色叶片的植株检测到了预期突变。试验结果表明我们构建的PE编辑系统能够进行精准编辑。2、PE系统对甘蓝CENH3基因的编辑。根据前人研究,对甘蓝CENH3基因设计G83E、Δ83G84T、E89K、R124C四个靶点突变（含氨基酸替换和删除）,并分别通过GG反应获得相应的peg RNA和g RNA,并将其加载到PE载体中,分别构建出PE-G83E、PE-83G84T、PE-E89K、PE-R124C载体。使用农杆菌介导转化法侵染To1000甘蓝下胚轴,经PPT筛选,获得再生植株。PE-G83E、PE-83G84T、PE-E89K、PE-R124C分别筛选出17、25、30、15个愈伤,分别获得82、91、135、120株再生植株,对所有株植株进行PCR鉴定,均含有Cas、MLV基因片段,其中部分植株MLV基因片段琼脂糖凝胶电泳条带较弱。对所有植株CENH3基因靶点进行sanger测序分析,其中PE-G83E、PE-83G84T未发现编辑植株,PE-E89K第107号植株在g RNA靶点处出现套峰,其他植株未发现编辑,PE-R124C第1号和9号植株在peg RNA靶点处出现套峰,其他植株未检测出编辑。综上所诉,PE编辑器未能在甘蓝中获得预期编辑,编辑效率为0%,但在PE-E89K再生植株g RNA靶点处出现编辑副产物,编辑效率为0.7%（1/135）,在PE-R124C再生植株peg RNA靶点处出现编辑副产物,编辑效率为1.7%（2/120）。3、PE编辑在烟草中的富集。本试验将NPTⅡ基因融合在MYB基因无义突变的3′端,将其插入p BI525中间载体表达盒,再将表达盒装载到p CAMBIA1300载体构建出p CA1300-MYB（TAG）-NPTⅡ载体。将p CA1300-MYB（TAG）-NPTⅡ载体和PE-MYB载体共转化烟草叶片,经过kan和PPT的双重筛选,得到了32个愈伤,其中6个愈伤出现紫红色斑点,其编辑效率高达18.8%（6/32）。对紫红色愈伤形成的芽进行sanger测序检测,发现预期编辑。试验表明利用富集系统,可以极大提高获得编辑植株的几率,但要解决再生植株为嵌合体的问题,还需要更多的研究。