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第二次工业革命加速了整个世界经济快速发展的步伐,世界的人口也随之大幅增加。粮食危机、环境破坏和能源危机等伴随着经济的发展和人口的大幅增长而日趋严重,同时,这些危机又严重阻碍了人类的生产和经济的发展,特别是粮食危机是重中之重。新中国成立60多年以来,我国经济取得长足的发展。在解决温饱问题、保证粮食安全、发展国民经济以及缓解能源危机等方面取得了巨大的成就。特别是仅占世界面积7%的土地养活了占世界人口20%的中国人民。但是,粮食问题一直是我国乃至世界的首要问题,是人类生存和经济发展的基础。
温室气体的大量排放及工业造成的环境污染的加重,使得环境加速恶化。特别是近些年,盐碱地的逐步扩大,旱灾和涝灾的频繁发生,以及部分地区的冷冻害和热害的发生,给作物的生长和生产带来了巨大的危害,轻则减产,重则大面积绝收。目前,充分利用作物非生物胁迫抗性基因培育出新的非生物胁迫的高抗品种,是提高作物非生物胁迫抗性最根本、最经济、最有效的方法。鉴于此,筛选非生物胁迫抗性相关的候选基因成为基因育种的首要问题。而候选基因的分子生物学研究成为了作物非生物学抗性研究的一个重要的必不可少的方面。本研究搜集已发表的大麦非生物抗性相关性状的QTL,研究,通过元分析获得非生物学抗性相关性状的真实QTL位点,并综合元分析结果和已有的基因表达图谱数据,分析非生物胁迫间在危害机制方面的相互关系,筛选非生物胁迫抗性相关的候选基因。然后分别研究大麦非生物胁迫抗性相关的调控基因AP2转录因子家族和功能基因广泛胁迫蛋白(USP)基因家族的基因特性,染色体定位,及其他相关的分子生物学研究,以期为作物非生物胁迫抗性的研究提供重要的分子生物学基础,为提高作物的非生物学抗性作出重要的贡献。主要研究结果如下:
1.MetaQTL揿件将大麦337个与非生物抗性相关性状的QTL,映射到参考图谱上,通过元分析获得了79个一致性QTL(MQTL)。26个与干旱胁迫抗性相关性状的一致性QTL(D-MQTL),11个与低温胁迫抗性相关性状的一致性QTL(T-MQTL),22个与盐胁迫抗性相关性状的一致性QTL(S-MQTL),17个与涝渍胁迫相关性状的一致性QTL(W-MQTL),3个与矿质毒性和营养缺乏胁迫抗性相关性状的一致性QTL(M-MQTL)。16个MQTL由不少于5个原始QTL组成,11个MQTL的置信区间不大于1.5cM,10个MQTL由贡献率大于50.0%的原始QTL组成。MQTL与原始QTL的分布趋势相似。大部分MQTL,位于染色体2H上和染色体5H上,位于染色体2H上的MQTL主要与涝渍和干旱胁迫抗性相关,位于染色体5H上的MQTL主要是与盐胁迫和低温胁迫抗性相关。在MQTL中,发现了10个组成型的MQTL:5个S-MQTL、2个W-MQTL和3个D-MQTL,但是并没有发现M-MQTL和T-MQTL的组成型MQTL。正如抗性性状间存在关联性相似,22.8%的MQTL间存在重叠区域。在这些MQTL重叠区域中,有3个重叠区域位于W-MQTL和T-MQTL之间,4个位于S-MQTL和T-MQTL之间,3个位于W-MQTL和D-MQTL之间,5个位于S-MQTL和D-MQTL之间,4个位于W-MQTL和S-MQTL之间,2个位于T-MQTL和D-MQTL之间,1个位于S-MQTL和M-MQTL之间。一共67个受非生物胁迫影响表达的候选基因分布于染色体上的MQTL区域内。尽管大多数候选基因位于单一的MQTL区域内,但是,依然有17个候选基因位于2个或者3个MQTL重叠的区域内。67个受非生物胁迫诱导的候选基因中,一共存在55个候选基因具有保守的结构域。在这些蛋白质中,发现9个与抗氧化相关,12个与电子/离子转移相关,3个与Ca2+结合相关,7个与ATP结合或ATP酶活性相关,3个与磷酸化相关。
2.通过搜索大麦HarvEST数据库和NCBI数据库,鉴定了24个含有保守的AP2结构域的AP2转录因子。大麦AP2转录因子除了ERF-B5、DREB-A1和DREB-A3三类,其他各类均有分布,包括:14个ERF亚族、6个DREB亚族、2个AP2亚族、1个RAV亚族和1个Soloist亚族。通过与拟南芥AP2转录因子的氨基酸序列的多重比对,发现在各个亚族中的AP2转录因子在DNA结合域和蛋白质互作的区域均存在保守的氨基酸残基,但是,大麦和拟南芥AP2转录因子各个亚族的与DNA结合的保守氨基酸残基和二级结构元件保守的氨基酸,均存在一定的差异。依据序列的特点成功克隆了8个大麦AP2基因。克隆的基因含有0、1或者2个内含子。大麦AP2转录因子的内含子的长度范围为76bp到1078bp。各个亚族内的同一个组中的大麦AP2基因在翻译和非翻译区内含子的分布与拟南芥的相似。这些基因翻译区的内含子均在保守的AP2结构域的前面,且内含子的剪切位点是变化多样的。克隆的8个AP2基因中,hv.2871定位于染色体3H短臂的末端,距离MWG571C标记13.7cM。Hv.737和hv.15732这2个基因定位于染色体7H断臂的末端,他们之间的遗传距离为11.1cM,其中,hv.8737位于染色体7H的末端。系统进化分析结果表明,相对于其他的几个亚族,AP2亚族的分子进化可能是相对独立的,而RAV和Soloist亚族之间,ERF和DREB亚族之间的进化关系则较为紧密。
3.搜索大麦HarvEST数据库,找到25个大麦USP基因的cDNA序列。其中,16个可以翻译成完整的蛋白质。通过比对大麦、拟南芥、甲烷球菌属的USP基因(1MJH)和嗜血菌属的USP基因(1JMV)的结合ATP的保守区的氨基酸序列,发现大部分氨基酸残基保守。通过序列分析聚类,大麦与拟南芥的USP基因被分成7个组。这7个组与大肠杆菌的USP基因完全分开。位于不同组的基因,其内含子和外显子的结构也不同。在蛋白质二级结构元件中,植物拟南芥和大麦与大肠杆菌间存在一些不同点,例如:在拟南芥和大麦USP基因的a1中包含‘S-X2-A-X-W’的序列框,而大肠杆菌中的USP基因并不存在此序列框。在7个分类组中,仅仅在Ⅶ组中的USP基因与1JMV相同,缺乏‘G/S-X2-G/S-X9-GS’序列框。与大肠杆菌的USP和1JMV相比,1MJH与拟南芥和大麦的USP基因系统进化关系更为紧密。利用特异性引物,成功克隆了9个大麦USP基因,均包含2或3个内含子,内含子的序列长度范围从75bp到941bp。这些内含子中,有2个位置固定在β2和α2之间,β4和α4之间。在这些USP基因中,第1个内含子的长度最长,位于中间的(第2或者第3个)内含子最短。内含子的剪接位点虽然变化多样,但是组Ⅰ的大麦USP基因的内含子1均为GU-AG类型。除了位于组Ⅶ的Hv.11351和Hv.11741的内含子3为GG-CA类型,其他的均为AG-GC类型。克隆的9个USP基因中,成功定位了5个基因于染色体上。Hv.3739位于标记Suk9M49n(17.1cM)和ksuF2A(13.5cM)之间,Hv.11351位于标记ABC160(10cM)和His4A(20.5cM)之间。另外3个位于其他不同的染色体上:Hv.7364位于染色体6H上的标记ksuA3D(12.8cM)和Nar7(11.9cM)之间,Hv.11741位于染色体3H上的标记Crg3B(10.5cM)和BAGY2CM61m(23.2cM)之间,Hv.23267位于染色体2H的标记Crg3A(5.4cM)和ABC252(7.8cM)之间。在盐处理的27h内,设定0、1、9和27h共4个时间点,分别检测各个USP基因在根和叶中的表达情况。Hr.7364、Hr.11351和Hr.11741在无盐胁迫的条件下RNA没有表达,而其他的6个基因在未加盐处理的情况下低量表达。Hv.3739、Hv.5327、Hv.23267、Hv.7364和Hv.9303这5个基因均在根和叶中有表达。而Hv.1561仅仅在根中有表达。Hv.11351和Hv.11741这两个基因在盐处理的27h内在根和叶中并没有检测到表达,而在盐处理一周后才检测到表达。大麦USP基因在0到9h间有一个表达峰,在9h后表达继续增高,这种表达情况在叶中尤为明显。USP基因在大麦盐敏感材料中的表达量高于耐盐材料。