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目的:1.通过铜负荷饮食法建立裸鼠的肝脏铜代谢异常疾病模型,分离同种裸鼠肝细胞悬液,予以腹腔内移植,研究肝细胞移植对裸鼠铜代谢的影响;2.通过检测脂质过氧化物质细胞色素P450(cytochrome protein P450,CYP450)、肝丙二醛(MDA)、裸鼠肝组织氧活性簇(ROS)及超氧化物歧化酶(SOD)的变化,探讨移植肝细胞影响裸鼠肝铜代谢的可能机制。方法:1.裸鼠肝脏铜代谢异常疾病模型的建立:裸鼠(4周龄,体重23±2.3g),于SPF级无菌动物饲养房正常饲养10天适应环境后,采用铜饮食负荷法造模,喂饲混有硫酸铜1.0g/kg的饲料和0.185%的硫酸铜水4周。通过代谢笼收集裸鼠24小时尿液测定尿铜值,抽血做肝功能检测来评价模型的建立。2.实验分组:将40只裸鼠肝铜代谢异常模型随机分为2组,肝细胞移植组(组1)及腹腔肝细胞培养液注射组(组2),每组各20只。取20只未造模裸鼠(同龄正常饮食饮水裸鼠)行肝细胞移植做正常代谢对照组(组3)。另取40只同龄裸鼠作1对1肝细胞移植的供体。3.裸鼠移植肝细胞悬液制备及实验干预。4.实验检测:分别在细胞移植前1h,移植后3d,7d,14d,28d对三组裸鼠心脏穿刺抽血0.1ml行肝功(ALT、ALB、AST)检测、血清铜(serum copper)含量测定、血清铜蓝蛋白(ceruloplasmin,CP)测定。在术后7天、28天分别对3组裸鼠行活检取部分肝组织,所取肝组织制成细胞匀浆检测肝脏铜含量,ELISA测细胞色素P450 2E1蛋白表达变化,肝组织匀浆的SOD活性,肝组织MDA含量,肝组织活性氧簇(ROS)浓度变化。移植后28天时行肝组织和移植细胞活检,肝组织以10%的福尔马林溶液固定,石蜡包埋切片,采用HE染色后,于光学显微镜下行病理学检测及肝铜染色。5.统计学分析计量资料使用均数±标准差描述,计数资料采用率和构成比描述;两组间的比较采用t分析;检验水准(а)设定为0.05,P<0.05为差异具有统计学意义。三组间比较采用方差设计,检验水准(а)设定为0.05,P<0.05,上述统计分析均由SPSS19.0统计软件进行。结果:1.通过铜负荷饮食后,建模组血清铜(4.38±0.17μg/ml)明显高于正常喂养组(1.05±0.05μg/ml)(P<0.05),建模组尿铜数值(137.6±13.4μg/24h)明显高于正常喂养组尿铜值(25.5±6.1μg/24h)(P<0.05)。铜过量负荷后,建模组肝功检测ALT、AST数值明显高于正常喂养组(P<0.05),建模组蛋白合成水平ALB低于较正常喂养组(P<0.05)。2.裸鼠移植肝细胞悬液制备良好,光镜下见典型肝细胞特征,台盼蓝染色细胞活性大于90%。术后三组裸鼠于28d活检时均无死亡。28天活检时候可见组1、组3裸鼠腹腔内生长的肝细胞团块,细胞团块活检HE染色于光镜下可见肝细胞生长良好。3.术前、术后组1、组2各时间点AST、ALT、血清铜均明显高于组3,蛋白合成水平及血清铜蓝蛋白含量均低于组3,有显著差异性(P<0.05)。移植术前1h组1裸鼠AST、ALT、ALB、血清铜、血清铜蓝蛋白检测结果与组2比较无明显差异性(P>0.05),组1术后3d,7d、14d、28d时AST、ALT、ALB、血清铜、肝铜蓝蛋白检测结果与组2比较有显著差异性(P<0.05)。术后28d所测组1肝铜含量(35.97±1.45μg/g)明显低于组2肝铜水平(53.30±3.17μg/g)(P<0.05)。4.裸鼠肝组织病理学检测:干预后28d,组1肝组织肝细胞结构略显混乱,轻微水肿,肝细胞呈条索状排列,可见少量点状坏死肝细胞,少量肝细胞核浓缩深染,有的细胞核溶解消失。组2可见自身肝脏肝细胞出现肿胀、气球样变、脂肪样变,肝细胞内缺少胞浆存在,代之以大小不等的空泡,肝细胞核被推向细胞周围或居中央而坏死消失。组3细胞结构完整,相邻的肝板相互吻合连接,可见所取标本肝细胞组织结构正常,中央静脉清晰,肝小叶结构完整,肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列,胞质、胞核完整,肝细胞无明显病变表现。采用红氨酸铜染色法对28d组1,组2肝脏切片进行铜染色。组1的肝细胞内铜颗粒沉积明显少于组2。5.干预后28d,组1 CYP450 2E1水平(0.95±0.02 nmol/mg)低于组2水平(2.41±0.06 nmol/mg)(P<0.05),组1 MDA含量(4.25±0.14 nmol/mg)低于组2水平(7.72±0.10 nmol/mg)(P<0.05),组1 ROS含量(11.28±1.26nmol/mg)低于组2水平(25.39±2.33 nmol/mg)(P<0.05),而组1 SOD含量(285.59±7.11 u/mg.prot)高于组2水平(220.42±7.99u/mg.prot)(P<0.05)。结论:1.裸鼠肝细胞同种移植可以有效地减轻肝铜代谢异常裸鼠的肝铜沉积,改善其肝功能,加速铜的代谢。2.其保护机制可能与移植肝细胞可有效减轻铜代谢障碍引发的脂质过氧化损伤作用有关。