研究背景与目的肺纤维化是一种慢性、进行性的肺间质的炎症性疾病,其发生率为万分之一,自确诊后五年生存率仅为30%-50%[1-3]。这一疾病的主要病理学改变是肺间质中细胞增殖以及细胞外基质(ECM extrace1lular matrix)过量沉积[2,4]。疾病发生机制尚不明确,但已有研究表明炎症、上皮细胞的损伤、凋亡尤其是上皮间质转换(EMT,epithelial-mesenchymal transition)可能在肺纤维化的发生发展中发挥着举足轻重的作用[5-8]。上皮细胞向间质细胞转化的过程称之为上皮间质转化,其特征性改变是细胞上皮特征的逐渐消失(例如:细胞间相互连接,较强的顶膜面-基底膜面极性),而间质特性的愈益增强(例如:ECM复合物的产生、迁移和侵袭的能力)。另外,在EMT的过程中,间质细胞的标记物如α-SMA和波形蛋白都是高表达的,而上皮细胞标记物E-钙黏素和细胞角蛋白却是低表达的[6,9-11]。百草枯(PQ,paraquat)是一种剧毒除草剂,广泛应用于世界各地,注射PQ入体可以引起多种脏器尤其是肺脏的损伤,研究认为PQ诱导的肺损伤包括急性期和慢性期改变,其急性期主要表现为上皮细胞损伤、肺水肿和炎症;而慢性进行性肺纤维化是非常严重的慢性肺损伤,死亡率高达25%-70%,通常在注射PQ数天至数周后发病[12]。然而,肺纤维化分子机制并不明确。白介素-6(IL-6,Interleukin 6)是一种多功能性细胞因子,通过不同信号通路参与多种自体免疫性疾病和慢性炎症性疾病的发生发展[13]。IL-6细胞来源广泛,主要来源是巨噬细胞和单核细胞[14,15]。巨噬细胞是免疫应答的关键性组成部分之一,也是疾病过程中炎症反应的主导调节因素,巨噬细胞释放的IL-6进入细胞间隙后可通过旁分泌的方式影响纤维化进程和炎症反应。IL-6通过IL-6受体和gp130来发挥其生物学活性,IL-6与IL-6膜结合型受体结合后激活gp130二聚体,三者共同组成具有高亲和力的功能型复合物。功能型复合物激活JAKs(Janus kinases)从而激动gp130酪氨酸759来源的SHP-2/ERKMAPK信号通路和gp130 YXXQ介导的JAK/STAT信号通路[16],使IL-6具备同时发挥两种不同甚至相对立功能的能力,而IL-6最终的功能趋向可能是多种信号通路共同作用的结果[17]。IL-6能够促进胶原纤维沉积于多种器官,例如肾脏、心脏以及皮肤等[18],研究报道IL-6在发生肺纤维化的人以及小鼠体内高表达[17,19-23],但是,IL-6在纤维化中的作用以及调节机制仍亟待探究。表观遗传学是研究基因核苷酸序列不发生改变的情况下基因表达可遗传变化的一门分支学科。组蛋白修饰(组蛋白乙酰化、甲基化、磷酸化、脱氨基化、β-N-乙酰葡糖胺、ADP核糖基化、泛素化和苏素化等)作为其研究对象之一,通过影响组蛋白与DNA的亲和性来改变染色质的结构状态调节基因表达。组蛋白乙酰化是最常见的组蛋白修饰,主要通过组蛋白乙酰化酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)达到修饰目的。研究报道组蛋白乙酰化在炎症反应、纤维化和PQ所致帕金森模型中发挥作用,由此,我们猜想组蛋白乙酰化在PQ所致肺纤维化和急性炎症中是否具有调控作用以及如何发挥调控作用?CRISPR-ON是一种RNA介导的转录激活系统,是新型、高效诱导特定基因表达的基因编辑系统[24,25]。CRISPR-ON由三部分组成:Cas9-VP64,sgRNA和MS2-P65-HSF1,三者共同形成蛋白复合物-协同激活介质(SAM),能高效激活同一细胞单个或多达10个内源基因的转录[26]。本课题以CRISPR-ON为探索调剂机制的一种重要手段,探究PQ肺纤维化中可能的调控机制。因此,本研究的主要目的是明确IL-6在PQ诱导的肺纤维化中的作用,同时探究表观遗传在IL-6转录调控的作用。第一部分:IL-6在PQ肺纤维化中的作用研究方法:1.构建并验证PQ中毒的动物模型。2.通过检测mRNA及蛋白表达的方法从PQ动物模型中筛选出表达异常的基因。3.通过对细胞系的筛选确定升高表达的IL-6的来源。4.阻断IL-6信号通路以明确IL-6在PQ肺纤维化中的作用。5.通过巨噬细胞与上皮细胞共培养实验探究IL-6在肺纤维化中的作用机制。结果:1.C57BL/6小鼠腹腔注射PQ10mg/kg 48h和1month构建PQ中毒的急、慢性动物模型,使用HE染色和MASSON染色验证了模型构建成功。2.提取动物模型肺组织RNA并采用qPCR筛选了 IL-6、IL-1β、IL-8、COX-2、MMP9、TnF-α和VCAM1等炎症及其相关细胞因子,发现IL-6在动物模型中呈PQ剂量依赖性增高,同时蛋白检测结果和mRNA的结果一致。3.使用PQ处理HLF、16HBE和BMDM发现IL-6只在BMDM中呈时间依赖性和剂量依赖的升高。4.小鼠腹腔注射IL-6受体抑制剂Gp130Fc和PQ后检测小鼠肺纤维化的程度,发现纤维化相关基因在单独注射PQ的小鼠肺脏中表达高于对照组,而在给予Gp130Fc的小鼠肺脏中表达降低。同时,MASSON染色也证实了 Gp130Fc可以减轻肺纤维。另外,在3T3细胞中给予重组IL-6后纤维化相关基因变化无明显变化,排除了 IL-6直接影响纤维细胞的作用方式。5.通过共培养实验方法发现上皮细胞中EMT相关基因在给予PQ处理的BMDM裂解液后高表达,而同时给予Gp130Fc后表达降低。由此证明了BMDM分泌的IL-6通过促进EMT在肺纤维化中发挥重要作用。结论:我们成功构建PQ肺损伤的急性肺炎症模型和慢性肺纤维化的模型,在动物模型中筛选多种细胞因子,并通过一系列的研究手段确定并验证了 IL-6在肺纤维化中的重要作用。此外,在对PQ肺纤维化中IL-6高表达的深入研究发现,IL-6通过EMT促进PQ肺纤维化的发生发展。第二部分:IL-6在PQ肺纤维化中调节机制的研究方法:1.在体内、体外实验中给予HDAC抑制剂和HAT抑制剂后,检测IL-6的mRNA和蛋白表达以探究组蛋白乙酰化对于IL-6表达的影响。2.在体内、体外实验中给予HDAC抑制剂和HAT抑制剂后,检测组蛋白乙酰化对PQ所致肺损伤的影响。3.通过检测HDAC各亚型的表达进一步明确HDACs在PQ所致肺纤维化中的重要作用。4.通过双荧光素酶报告基因检测、CRISPR-ON和ChIP实验探究IL-6的表观遗传调控机制。结果:1.通过qPCR和ELISA实验发现IL-6受组蛋白乙酰化调控。2.通过HE染色、MASSON染色、免疫荧光、qPCR和Western Blot实验发现组蛋白乙酰化对PQ肺损伤和EMT相关基因表达具有调节作用。3.经qPCR检测,HDAC3在PQ处理的肺组织和BMDM中的呈剂量依赖性和时间依赖性降低。4.双荧光素酶报告基因检测结果显示VPA增强IL-6启动子区活性,CRISPR-ON技术证实VPA、Anacardic acid分别促进和抑制IL-6的转录,另外,ChIP-qPCR技术也验证了巨噬细胞中IL-6启动子区的表观遗传改变。结论:实验结果显示IL-6在PQ处理的肺组织和BMDM中的表达受组蛋白乙酰化的调控,同时HAT抑制剂能够减轻PQ肺纤维化。随后,我们在体内、体外检测HDAC各亚型的表达发现HDAC3呈PQ剂量依赖性和时间依赖性的降低,此结果和IL-6的表达趋势恰好相反,于是我们推测IL-6的表达可能主要由HDAC3调控。最后,双荧光素酶报告基因检测、CRISPR-ON以及ChIP的实验结果表明IL-6启动子区受到组蛋白乙酰化的调控。小结研究报道高表达的IL-6在纤维化疾病中具有作用,但IL-6在其中的作用机制及调控机制尚不明确。本研究的首要目的是明确IL-6在PQ介导的肺纤维化中的作用并探究表观遗传是否参与IL-6的转录调控。我们构建了 PQ中毒的动物模型和细胞模型,发现IL-6的mRNA和蛋白表达在处理组小鼠的肺脏及细胞中呈时间依赖性和剂量依赖性增高。同时,研究结果表明IL-6是通过增强EMT促进PQ肺纤维化发生发展的。另外,IL-6在肺纤维化中的表达和功能受表观遗传调控,首先,HDAC抑制剂促进IL-6在肺纤维化中的表达,HAT抑制剂抑制IL-6表达;其次,CRISPR-ON促进IL-6转录的作用受到HDAC抑制剂的增强和HAT抑制剂的减弱;最后,我们通过ChIP实验发现HDAC抑制剂增强IL-6启动子区组蛋白激活标记物H3K4me3和H3K9ac表达。综上,IL-6通过EMT在PQ诱导的肺纤维化中发挥作用并且在体内、外都受到组蛋白乙酰化调控。