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目的：Pim-1基因定位于人类6号染色体短臂21区（6p21）,其编码蛋白属于丝/苏氨酸激酶家族，它与AKT激酶一起被认为是调节细胞生存以及代谢的两大重要的激酶成员。Pim-1作为一种癌基因，可单独或协同其他癌基因（c-myc, N-myc等）诱导细胞恶性转化；引起基因的不稳定性；以及促进细胞增殖、抑制凋亡等，从而参与肿瘤的发生及进展过程。Pim-1是许多细胞因子信号通路下游重要的效应器之一，其表达可被多种细胞因子、丝裂原以及激素所诱导。目前有关癌基因Pim-1的研究主要见于血液系统恶性肿瘤，并且其特异抑制剂的抗肿瘤作用已到达临床前期阶段。而在实体瘤的相关研究主要见于前列腺癌。目前有关Pim-1在非小细胞肺癌（NSCLC）中的研究少见报道。鉴于此，本文对其在非小细胞肺癌中的表达及其生物学功能进行了较为系统的实验研究。方法：1Pim-1在人NSCLC中的表达情况利用Western Blot方法，检测27例非小细胞肺癌及其匹配的正常肺组织以及NSCLC细胞株（H460,A549, H1299, H157, SK及H358）中Pim-1蛋白的表达；同时采用Real-time PCR方法检测上述其中24例标本中Pim-1mRNA的表达；采用免疫组织化学染色明确Pim-1蛋白在NSCLC组织中表达的定位。2Pim-1在NSCLC中的生物学功能研究利用特异性Pim-1siRNA转染A549和H1299细胞，从细胞增殖（MTT及平板克隆形成）、细胞周期分布（FCM）及细胞迁移能力（划线实验及Transwell实验）方面，观察Pim-1在非小细胞肺癌中的作用。在体外实验的基础上，进一步通过制备裸鼠肿瘤模型，给予Pim-1shRNA质粒或对照质粒瘤内注射，观察敲低Pim-1基因后对肿瘤增殖的影响。3不同肿瘤微环境下Pim-1的表达情况分别给予A549和H1299细胞EGF、CoCl2及抗肿瘤药物（Docetaxel、Cisplatin）后，观察Pim-1蛋白表达的变化（Western Blot）以及对细胞增殖的影响（MTT）。结果：1Pim-1在人原发非小细胞肺癌中的表达情况Western bolt检测结果表明，在27例NSCLC病例中，24例肿瘤组织Pim-1蛋白的表达明显高于其匹配的正常肺组织。Real-time PCR检测结果表明，37.5%（9/24）病例中Pim-1mRNA在肿瘤组织中的表达显著高于其匹配的正常肺组织。进一步分析发现，Pim-1mRNA平均表达量在肿瘤组织与正常肺组织中的差异无显著性（p>0.05）。免疫组织化学染色结果表明，Pim-1蛋白的阳性表达可见于肿瘤细胞胞核和/或胞浆中。此外，在6个NSCLC细胞株中检测了Pim-1蛋白的表达情况，除外H460为阴性表达外，其他细胞（A549、H1299、H157、SK-MES-1及H358）中均可检测到Pim-1蛋白的表达。2Pim-1在非小细胞肺癌中的生物学功能研究2.1利用siRNA干扰技术，体外观察Pim-1在非小细胞肺癌中的作用为进一步探讨Pim-1在肺癌中的生物学效应，我们采用siRNA干扰技术，将Pim-1siRNA转染A549和H1299细胞，从细胞增殖、细胞周期分布以及迁移方面观察Pim-1在NSCLC中的作用。2.1.1siRNA干扰效率的检测：于转染后48小时收集细胞检测Pim-1siRNA的干扰效率。Real-timePCR结果显示，与Negative Control siRNA（NC siRNA）对照组相比，Pim-1mRNA的表达在A549细胞和H1299细胞Pim-1siRNA转染组细胞中分别降低了80%和86%。Western blot检测结果同样表明，Pim-1蛋白的表达在Pim-1siRNA转染组明显低于对照组细胞。上述结果表明所用Pim-1siRNA序列可以有效干扰Pim-1的表达。2.1.2Pim-1siRNA转染对细胞增殖的影响：MTT检测结果表明，给予Pim-1siRNA转染后72h和96h，A549细胞及H1299细胞的增殖活性明显低于对照组（p<0.05）。此外，在A549细胞中采用克隆形成实验观察了Pim-1siRNA转染对细胞增殖的影响。结果表明，Pim-1siRNA转染组A549细胞克隆形成数目较对照组明显减少。综上结果提示，Pim-1siRNA转染可抑制A549和H1299细胞的增殖能力。2.1.3Pim-1siRNA转染对细胞周期分布的影响：FCM检测结果表明，与对照组相比，转染后48h Pim-1siRNA转染组G0/G1期细胞比例显著增加（p<0.05），同时S期细胞比例显著降低（p<0.05）。上述FCM检测结果在A549及H1299细胞均得到证实。结果提示Pim-1siRNA可以使细胞停滞于G0/G1期。2.1.4Pim-1siRNA转染对细胞迁移力的影响：采用细胞划痕实验观察Pim-1siRNA转染对A549和H1299细胞迁移力的影响。实验结果表明，至划痕后48h，可见Pim-1siRNA转染组A549和H1299细胞朝向划痕迁移的速度明显低于对照组细胞。此外，采用Transwell方法观察了Pim-1siRNA对A549细胞迁移能力的影响，于接种后24小时计数穿过膜的细胞数目并拍照记录。结果表明在Pim-1siRNA组穿过膜的细胞数目明显低于对照组，差异显著（P<0.05）。2.2体内观察Pim-1对肿瘤增殖的影响：2.2.1Pim-1shRNA质粒的合成与效率检测：Pim-1shRNA质粒委托广州复能基因公司构建，将质粒转染H1299细胞检测其干扰效率。Real-time PCR结果表明HSH013152-1-CH1对Pim-1mRNA的干扰效率最显著（降低60%左右）。因此，后续的实验中我们选择HSH013152-3-CH1（psi-H1-Pim-1）质粒进行研究。2.2.2A549细胞荷瘤裸鼠模型的建立及处理每只裸鼠于右侧腋窝区皮下注射1×107个A549细胞，接种后3周肿瘤体积达到100mm3左右。此时将裸鼠随机分为两组：空质粒组和Pim-1shRNA质粒组，分别给予空质粒（100μg/100μl/次）及Pim-1shRNA质粒（100μg/100μl/次）瘤内多点注射。每隔4天注射一次，连续注射4次。以相对肿瘤体积（Relative Tumor Volume, RTV）为依据，观察上述处理对肿瘤细胞增殖的影响。2.2.3敲低Pim-1基因对肿瘤细胞增殖的影响以肿瘤生长时间和RTV做曲线发现，在注射后10天内，各组间肿瘤生长情况无明显差异。直到处理后13天开始，psi-H1-Pim-1质粒注射组肿瘤细胞的增殖活性显著下降，与对照组相比差异显著（p<0.05）。注射质粒后第18天取出种植瘤进行相关检测。HE染色结果证实接种瘤均为腺癌，与A549细胞类型一致。同时，提取裸鼠肿瘤组织总RNA和总蛋白，检测Pim-1在两组间的表达情况。Real-time PCR结果表明，与对照组相比，Pim-1mRNA的平均表达量在psi-H1-Pim-1质粒注射组降低了30%。Western bolt及免疫组织化学染色结果显示，Pim-1蛋白在psi-H1-Pim-1质粒注射组的表达明显低于空质粒组。上述结果验证了瘤内多点注射psi-H1-Pim-1质粒可以一定程度的敲低Pim-1基因的表达。通过体内实验进一步表明，敲低Pim-1基因可抑制肿瘤细胞的增殖活性。3不同肿瘤微环境下Pim-1的表达3.1EGF处理对细胞Pim-1表达的影响：将A549和H1299细胞于含0.5%血清的RPMI-1640培养基中饥饿24h后，加入50ng/μl EGF刺激2h，提取蛋白进行检测。Western Blot结果显示经EGF刺激后，A549和H1299细胞中Pim-1蛋白的表达较空白对照组显著增加，结果提示EGF可以诱导Pim-1的表达。3.2CoCl2处理对细胞Pim-1表达的影响：给予A549和H1299细胞200μmol/L CoCl2处理24h，模拟细胞缺氧环境，收集蛋白检测Pim-1蛋白表达的变化。Western Blot结果显示，两种细胞在给予CoCl2处理后，细胞Pim-1的表达明显高于空白对照组，结果提示缺氧环境下可以诱导A549和H1299细胞内Pim-1的表达。3.3抗肿瘤药物（Doctaxel、Cisplatin）处理对细胞Pim-1表达的影响：分别给予A549细胞Doctaxel（10nM）及Cisplatin（2μg/ml）处理后48h，Pim-1蛋白的表达较空白对照组增加。在H1299细胞，分别给予Doctaxel（100nM）及Cisplatin（2μg/ml）处理24h，可见Pim-1蛋白的表达较空白对照组显著增加。3.4Pim-1siRNA转染联合Docetaxel或Cisplatin处理对细胞增殖的影响MTT检测结果表明，A549细胞给予Pim-1siRNA联合Docetaxel处理后72小时，可见细胞增殖活性显著低于NC siRNA联合Docetaxel处理组细胞（p<0.05）。同时，A549细胞给予Pim-1siRNA联合Cisplatin处理后48h及72h，均可见细胞增殖活性显著低于NC siRNA联合Cisplatin处理组细胞（p<0.05）。此外，给予H1299细胞Pim-1siRNA联合Docetaxel处理后72小时、Pim-1siRNA联合Cisplatin处理后48h，Pim-1siRNA转染组细胞OD570nm值均明显低于对照组（p<0.05）。上述结果提示Pim-1siRNA可以增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。结论：1Pim-1蛋白的表达在人原发非小细胞肺癌组织中常常表现为过表达。2Pim-1siRNA转染可抑制A549和H1299细胞的增殖能力、使细胞周期阻滞于G0/G1期，同时可以降低两种细胞的迁移力。3Pim-1shRNA质粒瘤内注射可以降低Pim-1在裸鼠移植瘤内的表达，同时抑制肿瘤细胞的增殖活性。4EGF、CoCl2以及抗肿瘤药物Docetaxel或Cisplatin处理，可以诱导A549和H1299细胞Pim-1的表达。5Pim-1siRNA转染可以增加细胞对抗肿瘤药物的敏感性，针对Pim-1的特异抑制剂有望成为NSCLC肿瘤治疗的新靶点。