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研究背景:肝脏纤维化是肝脏受到慢性损伤时的一个自我愈合过程,又是所有慢性肝病进展成肝硬化的共同病理基础,肝纤维化是可逆的,而肝硬化是不可逆的。积极开展慢性肝病的早期防治,以减缓甚至逆转肝纤维化的发生发展,显得尤为重要和紧迫。因此,国内外许多学者围绕肝纤维化发生、发展的各个环节,从化学药物、天然药物、生物制剂、基因治疗等不同领域进行了大量抗肝纤维化药物的研究工作。先后开展了皮质类固醇激素、水飞蓟素、干扰素、秋水仙碱、载体介导的基因转移等的研究。在我国还开展了丹参、黄芪、桃仁、861合剂、扶正化瘀胶囊、鳖甲软肝片等单味中草和复方中药对肝纤维化防治的研究。但以上研究或只是在动物实验中进行,或虽已用于临床,但抗纤维化效果甚微。吡非尼酮(pirfenidone,PFD)是一种新型的具有广谱抗纤维化作用的药物,在大量的体内外试验中发现其可以抑制肝纤维化、肺间质纤维化、肾纤维化作用等。在美国,PFD已进入肺纤维化治疗的Ⅲ期临床实验。PFD通过抑制脂质过氧化,抑制TNF-α、NF-κB等因子,减轻炎症反应,调节各种细胞因子,抑制HSC的活化和增殖,阻止肝纤维化的形成,同时可以调节ECM的降解,逆转肝纤维化。AKF-PD系PFD的me-better药物,是由中南大学陶立坚、胡高云等合成得到的一种新的吡啶酮类化合物,已获得国家发明专利,前期已在GLP实验室证明其毒性低,在细胞实验和动物实验中显示了其抗肾间质纤维化的作用。AKF-PD对肝纤维有无作用?通过什么途径起作用?是其研究中的重要问题。本文作者与陶立坚课题组共同进行了前期研究,在抗大鼠肝纤维化的预实验中观察了初步疗效、摸索了有效剂量。本实验旨在观察AKF-PD对二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine,DMN)诱导的大鼠肝纤维化的预防性治疗效果,并初步探讨其抗肝纤维化的机制。第一部分AKF-PD对DMN诱导大鼠肝纤维化预防性治疗的效果的观察目的:观察AKF-PD对二甲基亚硝胺(DMN)诱导的大鼠肝纤维化预防性治疗作用。方法:140只wister雄性大鼠,随机分为7组,分别为正常组、正常给药组、模型组、AKF-PD预防性治疗组(分3个剂量组:1000mg/kg,500mg/kg,125mg/kg)、吡非尼酮(PFD)预防性治疗组(PFD500mg/kg),每组20只。模型组和各个药物预防性治疗组用1%DMN腹腔注射,1ml/kg,每天一次,每周连续三次,共四周;造模同时各治疗组给予相应药物、相应剂量灌胃,每天一次,共四周。最后一次造模后第5天处死所有大鼠,留取血清、肝脏组织分别行:(1)生化检测:血清ALT、AST、TBIL、ALB(2)肝组织病理检查:HE和Masson染色行肝组织炎症、纤维化半定量评分(3)高效液相色谱分析法检测:肝组织内羟脯氨酸含量,结果:1.大鼠全部存活。2.肝功能改变:血清AST、TBIL:模型组比正常组显著增高(P＜0.01);AKF-PD预防治疗组、PFD预防治疗组比模型组显著降低(P＜0.05)。血清ALB:模型组比正常组显著降低(P＜0.01);AKF-PD预防治疗组、PFD预防治疗组比模型组显著增高(P＜0.05)。3.肝组织炎症半定量结果:模型组比正常组显著升高(P＜0.01);AKF-PD预防治疗组、PFD预防治疗组比模型组显著降低(P＜0.01)。4.大鼠肝脏肝纤维化半定量结果:模型组比正常组显著升高(P＜0.01);AKF-PD预防治疗组、PFD预防治疗组比模型组显著降低(P＜0.01),5.肝组织羟脯氨酸含量,模型组比正常组显著增高(P＜0.01),AKF-PD预防治疗组、PFD预防治疗组比模型组显著降低(P＜0.01)。结论:1.AKF-PD降低DMN诱导肝纤维化大鼠血清AST、TBIL,增加ALB,减少肝组织炎性细胞浸润、变性、坏死,从而降低肝组织炎症半定量评分。减轻DMN对大鼠肝脏炎症反应,保护肝细胞作用。2.AKF-PD降低大鼠肝脏肝羟脯氨酸含量和减少纤维在肝脏的沉积,对DMN诱导的大鼠肝纤维化有预防性治疗作用。第二部分AKF-PD对DMN诱导大鼠肝纤维化的预防治疗机制的研究目的:观察AKF-PD对二甲基亚硝胺(DMN)诱导的大鼠肝的Ⅰ、Ⅲ型胶原、α平滑肌激动蛋白、转化生长因子β1、结缔组织生长因子表达和肝组织TIMP-1蛋白水平,探讨AKF-PD抗纤维化的作用机制。方法:(1)每组随机取5只大鼠肝组织行免疫组织化学染色:Ⅰ、Ⅲ型胶原、α平滑肌激动蛋白、转化生长因子β1、结缔组织生长因子表达。(2)每组随机取4只大鼠肝组织行real-time PCR检测:Ⅰ、Ⅲ型胶原、α平滑肌激动蛋白、转化生长因子β1、结缔组织生长因子m RNA表达,(3)每组随机取5只大鼠肝组织行Westernbloting检测肝组织TIMP-1蛋白水平。结果:1、肝组织免疫组织化学染色的结果:Ⅰ、Ⅲ型胶原、α-SMA、TGF-β1、CTGF表达水平,模型组比正常组显著升高(P＜0.01);AKF-PD预防治疗组、PFD预防治疗组比模型组显著降低(P＜0.01)。2、肝组织Real-time PCR检测韵mRNA结果:Ⅰ、Ⅲ型胶原、α-SMA、TGF-β1、CTGFmRNA表达模型组比正常组显著升高(P＜0.01),AKF-PD预防治疗组、PFD预防治疗组比模型组显著降低(P＜0.05)。3、肝组织Western bloting检测的TIMP-1蛋白结果:模型组比正常组显著增高(P＜0.01),AKF-PD预防治疗组、PFD预防治疗组与模型组比较显著降低(P＜0.05)。结论:1、AKF-PD通过下调肝组织中α-SMA、TGF-β、CTGF蛋白表达及mRNA的表达,抑制HSC的活化,降低大鼠肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量,阻止肝纤维化形成。2、AKF-PD通过降低TIMP-1蛋白,而调节细胞外基质的降解。全文总结AKF-PD是一种新的吡啶酮类化合物,于2005年9月获得国家发明专利(专利号ZL02114190.8),前期在细胞实验和动物实验中显示了其抗肾间质纤维化的作用。AKF-PD对肝纤维有无作用?通过什么途径起作用?是AKF-PD课题研究急需解决的重要问题。本研究首次研究AKF-PD对肝纤维化的影响。首次用DMN诱导的大鼠肝纤维化模型来观察AKF-PD预防性治疗肝纤维化的效果,首次研究AKF-PD抗肝纤维化的作用机制。本研究采用血清生化学,病理学的HE组织染色、Masson胶原染色、免疫组织化学染色,高效液相色谱法测羟脯氨酸含量,Realtime PCR,Western bloting等方法,从血清生化、组织、mRAN、蛋白的水平来评价AKF-PD预防性治疗肝纤维化的效果和探讨AKF-PD抗肝纤维化的机制。从而获得如下结果:①、AKF-PD具有降低大鼠血清AST、TBIL,增加ALB,减少肝组织坏死、变性、炎性细胞浸润,减轻DMN对大鼠肝脏炎症反应的作用。②、AKF-PD具有降低大鼠肝脏肝羟脯氨酸含量、Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量,减少纤维组织在肝脏的沉积的作用。③、AKF-PD具有下调肝组织中α-SMA、TGF-β、CTGF蛋白的表达和mRAN表达的作用。④、AKF-PD具有降低TIMP-1蛋白的作用。上述结果说明:AKF-PD对DMN诱导的大鼠肝纤维化有预防性治疗作用。其作用机制与其减轻肝脏炎症,降低肝组织α-SMA、TGF-β和CTGF的表达,阻止ECM形成。降低肝组织TIMP-1蛋白,调节ECM降解有关。研究结果为AKF-PD治疗肝纤维化提供了实验依据。