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磷脂酶A2(EC3.1.1.4)是一类能水解磷脂甘油C-2酯键生成游离脂肪酸以及溶血磷脂的酶类,广泛存在于蛇毒,蜂毒,哺乳动物胰脏,植物组织以及以一些链霉菌属的微生物中,其在细胞磷脂消化,新陈代谢,信号转导以及宿主防御等生理过程中起到很重要的作用。在工业上,其可用于植物油脱胶,制备溶血磷脂,不饱和脂肪酸等。目前工业应用的磷脂酶A2大多是从蛇毒或动物的胰腺直接提取的,其产量较低,成本较高。我们尝试利用大肠杆菌表达系统来实现对其进行高表达,同时对其进行包涵体复性与酶学性质的研究,这将为以后对该酶的生产工艺以及工业化应用打下很好的基础。本研究的方法及相关研究结果如下:1、为了实现紫红链霉菌分泌型磷脂酶A2在大肠杆菌中的高表达,借助相关的软件以及网站分析了其基因的密码子使用情况,在不改变原有氨基酸序列的情况下,综合考虑mRNA的二级结构,局部GC含量以及大肠杆菌密码子偏好性,替换掉不合适的密码子,从而消除了基因局部的高GC区域,使得基因GC含量由66.8%下降为52.7%,同时优化了mRNA二级结构,使其最小自由能由186.7KJ/mol下降到103.5KJ/mol。2、通过化学合成获取优化基因后插入表达载体pET-30c(+)中,经酶切和测序鉴定无误后转化E.coli Rosetta(DE3)菌株,用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,结果经SDS-PAGE分析,优化后的磷脂酶A2基因在大肠菌主要以包涵体的形式得到了高表达,表达量占细胞总蛋白35%以上,包涵体经超声洗涤后,目标蛋白的纯度达到85%。3、对包涵体形式的磷脂酶A2进行稀释复性研究,并用Bradford method法测定了磷脂酶A2的产量,最后,测定了复性后重组磷脂酶A2的部分酶学性质。结果表明目标蛋白的产量为1.2g/L菌液,复性后的酶液纯度达到90%以上,比活力不低于3.6U/mg,其最适反应温度为50℃,最适反应pH为8.0,最佳钙离子浓度为6.0mM。综上所述,我们成功地在大肠杆菌中过量表达并复性得到具一定活性的重组紫红链霉菌2917磷脂酶。