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随着我国人口结构逐渐老龄化,缺血性脑卒中的发生率居高不下且明显高于世界平均水平,特别是在东北地区,由于气候和饮食习惯等因素,缺血性脑血管病的发生更为常见,给患者带了不可估量的伤害,同时给社会及家庭带来的沉重的负担。缺血再灌注损伤是缺血性脑卒中后的一个极为重要的病理生理过程,近年来的研究表明,缺血再灌注损伤的发生是一个复杂的过程,与众多因素相关,因此研究缺血再灌注损伤的机制,可能是治疗缺血性脑血管病的基础。线粒体作为一个能量中心,是细胞制造能量及有氧呼吸的主要场所,除此以外,线粒体还参与诸如1、细胞信息传递和细胞凋亡等过程,并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力,因此保持线粒体的稳态对细胞的转归及机体的功能尤为重要。线粒体的结构和功能损伤在脑缺血再灌注早期出现,是脑缺血后级联反应的"启动点";是脑缺血直接损伤和迟发性神经元坏死的主要原因之一,也是启动细胞凋亡的关键因素。多年的研究发现,当缺血性脑卒中发生时,线粒体稳态被破坏,导致细胞色素C被释放,进而引起凋亡的发生。Omi/HtrA2是一个种寡聚丝氨酸蛋白酶,位于线粒体膜间隙中,正常情况下它在线粒体内外的流动保持着动态平衡,当这种平衡被打破时可通过多种途径诱导细胞凋亡的发生。本文即采用激光扫描共聚焦、蛋白电泳、PCR-Array等技术,研究大鼠脑缺血再灌注后线粒体的损伤途径。丁苯酞作为我国自主研发的药物,其主要成分是消旋-3-正丁基苯酞,通过多年的临床应用及实验研究证明了其可以通过多种途径对神经细胞达到保护作用,且具有较好的安全性。本研究运用改良经典线栓法建立大鼠大脑中动脉缺血(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,运用 Omi/HtrA2 特异性抑制剂UCF101与丁苯酞对比研究,通过观察Omi/HtrA2在线粒体内外的表达;X染色体连锁凋亡抑制蛋白(XIAP),caspase-3、-9,线粒体塑形蛋白Optic Atrophy 1(OPA1),Caseinolyticprotease(ClpP)等的变化;运用蛋白芯片技术检测线粒体及线粒体能量代谢信号通路相关基因的表达,从而探讨丁苯酞对线粒体的保护作用,为其更好的应用于临床提供理论基础。第一部分脑缺血再灌注后线粒体的损伤和UCF-101对线粒体的保护作用及机制目的:探讨脑缺血再灌注后线粒体的损伤和UCF-101对线粒体的保护作用及机制方法:选择健康成年雄性SD大鼠,随机分为假手术组、MCAO组、MCAO+UCF-101组,每组10只。通过改良经典建立大鼠局灶性脑缺血模型,缺血1.5h,于缺血后75min给予UCF-101(10umol/kg)或同等量生理盐水腹腔注射,待大鼠完全清醒后,评价大鼠行为学。再灌注24小时,处死取脑。TUNEL染色检测神经元的凋亡情况;激光扫描共聚焦法检测Omi/HtrA2、caspases-3、caspases-9、PARL 蛋白的变化;Western blot 法检测 Omi/HtrA2、caspases-3、caspases-9、PARL、CHOP、ClpP 等蛋白的表达情况。结果:与MCAO组(32.81±3.44)相比,MCAO+UCF-101 组(18.62±2.28)神经元的凋亡指数明显减少p<0.01;激光共聚焦结果显示,MCA0组vs MCAO+UCF-101组 0mi/HtrA2和PARL的表达被抑制;Westernbolt 检测0mi/HtrA2、caspases-3、caspases-9、PARL、OPA1、XIAP、CHOP、ClpP蛋白的表达被抑制。第二部分NBP对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制目的:探讨NBP对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制。方法:选择健康成年雄性SD大鼠,随机分为假手术(sham)组、模型(MCAO)组、小剂量NBP(20mg/kg)、大剂量NBP(80mg/kg)组,每组7只。通过改良经典建立大鼠局灶性脑缺血模型,缺血1.5h,于缺血后1h给予NBP(20 mg/kg和80mg/kg)或同等量生理盐水腹腔注射。待大鼠完全清醒后,评价大鼠行为学。再灌注24小时后,处死取脑HE染色观察神经元损伤情况;TTC染色观察梗死体积变化;TUNEL染色检测凋亡情况;从而综合评价NBP对大鼠局灶行脑缺血再灌注损伤的保护作用。结果:与 MCAO 组(6.27±0.78)相比,无论是 20mgNBP 组(10.14±1.36)还是80mgNBP组(13.28±1.42),大鼠的神经功能都一定的改善P<0.01,且80mg组大鼠神经功能的改善优于20mg组P<0.05;BIVP,20mg NBP(22.28±2.47)、80mg NBP(16.42±2.76)VS MCAO组(28.42±1.91)体积明显缩小P<0.01,神经细胞无论从形态学还是凋亡方面都明显好于模型组。且呈剂量依赖型趋势,80 mg/kg组作用更为明显。第三部分NBP对线粒体的保护作用及可能机制目的:探讨NBP对线粒体的保护作用及可能机制方法:选择健康成年雄性SD大鼠,随机分为假手术组、模型(MCAO)组、小剂量NBP(20mg/kg)、大剂量NBP(80 mg/kg)组,每组7只。通过改良经典建立大鼠局灶性脑缺血模型,缺血1.5h,于缺血后1h给予NBP(20 mg/kg和80 mg/kg)或同等量生理盐水腹腔注射。再灌注24小时后处死取脑,激光扫描共聚焦法及 Western blot 法检测 Omi/HtrA2、caspases-3、caspases-9、PARL 蛋白的表达情况;运用PCR Array法检测NBP对线粒体及能量代谢相关基因mRNA的影响。结果:与 MCAO 组相比,NBP 组大鼠 Omi/HtrA2、caspases-3、caspases-9、PARL等蛋白的表达抑制明显;PCR Array结果显示,相比与Sham组,MCAO组的线粒体及其能量代谢均降低,而应用NBP后无论是线粒体还是线粒体能量代谢均得到了大幅改善。结论:1.脑缺血再灌注发生后对线粒体有多种损伤作用,而应用0mi/HtrA2特异性抑制剂UCF-101可以通过多种途径,减轻神经细胞的凋亡。2.早期应用NBP能够明显改善大鼠局灶性脑缺血再灌注后的神经行为学评分,减小梗死体积,抑制神经细胞的凋亡,减轻脑缺血再灌注损伤。3.NBP能够通过抑制Omi/HtrA2的表达从而减轻凋亡;同时NBP能够明显保护、改善脑缺血再灌注损伤后线粒体及能量代谢。