第一部分肺癌诊断和预后标志物研究第一章通过肺发育数据挖掘肺腺癌预后相关因子SMC4背景:肿瘤是一种非常复杂的分子网络病,肿瘤中的突变基因不仅数目众多、功能复杂而且处于动态的生物分子网络之中。肿瘤细胞的高度异质性、无序性以及癌前阶段发现难、取材难等特点给肿瘤研究带来了很大的挑战。越来越多的证据显示,胚胎发育和肿瘤发生在基因表达模式以及细胞生物学行为方面存在惊人的相似性,因此肿瘤可以被认为是一种的经历异常和无监控器官发育的特殊器官。但与肿瘤发生不同,胚胎发育是一个高度保守、高度一致性的精密调控过程。胚胎发育过程中,分子调控网络高度有序,而且不同个体的发育过程以及发育过程中发生的分子变化高度一致。因此利用胚胎发育作为研究肿瘤的模型可以在最大程度上规避肿瘤异质性给研究带来的种种困难,有助于阐明掩盖于高度异质性和无序下的肿瘤的内在本质特征。目的:本课题旨在探索通过胚胎发育和肿瘤发生的比较研究挖掘潜在肿瘤关键基因的可行性。材料和方法:分析了44例肺发育数据中1640个持续一致性变化的基因在69例肺腺癌数据中的表达模式,并使用这些基因构建了肺发育过程的分子共表达网络,通过筛选高连通度节点并利用派系过滤算法,找到了肺发育过程中的核心模块。在核心模块中我们选取了 一个尚未在肺腺癌中有过相关报道的分子SMC4(Structural maintenance of chromosome 4)进行了后续研究。在 69 例肺腺癌和44例肺发育表达谱数据中,利用相关性分析和基因功能富集分析研究SMC4在肺腺癌及肺发育过程中的功能。在TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库的506例带有总生存信息的肺腺癌测序数据中,使用对数秩检验和Cox比例风险回归模型评估SMC4基因表达水平与肺腺癌患者预后的关系。结果:肺发育数据中持续一致性变化的基因很多在肺腺癌中呈现出与肺发育过程相反的表达模式,这些基因之间存在着密切的相互作用主要参与细胞周期、细胞骨架组织、DNA代谢过程、细胞死亡和免疫反应等生物学功能。共表达网络和模块挖掘发现SMC4是肺发育过程中的关键分子之一。表达谱数据显示,SMC4分子的表达水平在肺发育过程中持续下调,但在肺腺癌组织中相对成人肺组织(非配对t检验,p = 0.0033)和相应癌旁肺组织(配对t检验,p = 0.00024)均高表达,并且在肺发育过程中和肺腺癌中发挥了十分相似的功能,参与细胞周期、RNA剪接、DNA代谢、细胞粘附和细胞外基质组织。生存分析显示,SMC4基因高表达与肺腺癌患者较差的总生存显著相关(Log-rank检验,p = 0.024),并且是肺腺癌独立的预后不良因素(多因素cox回归,p = 0.0432)。结论:胚胎肺和肺腺癌在分子表达水平上具有相似性。利用胚胎发育作为肿瘤研究模型,挖掘到的肺发育关键分子SMC4,在胚胎肺和肺腺癌中发挥着一致性的功能,并且与肺腺癌发生和预后显著相关。借助胚胎发育相关分子事件与肿瘤进行比较研究,是一种挖掘潜在的肿瘤相关关键基因和治疗靶点的有效方法,并有助于阐明肿瘤的发生机制。第二章肺癌患者外周血白细胞基因表达谱变化分析及肺癌特异性基因标签的鉴定背景:血液检测是一种疾病检测例行的手段之一。血液循环于全身各个组织器官中并与这些组织器官时时刻刻发生着物质交换,与此同时,血液中的各种免疫相关细胞也在监视着机体的状态,对于机体中出现的病理性改变做出相应的反应。肿瘤组织与机体免疫系统的相互作用,在肿瘤的发生发展中起到了十分重要的作用。作为一种异常组织,肿瘤组织产生的肿瘤抗原引起了机体抗肿瘤的免疫应答,同时为了逃避免疫系统的杀伤,肿瘤组织也反过来作用于免疫细胞抑制免疫反应,使宿主失去对肿瘤的免疫应答能力。在肿瘤与宿主免疫系统的相互作用过程中,作为行使免疫功能基本单位的各种白细胞,其中的mRNA表达发生了相应变化。由于血液取材容易,而且对人体创伤小,因此利用肿瘤外周血特异性基因检测肿瘤是一种很有吸引力的方法。目的:本课题旨在研究肺癌患者和健康人在外周血白细胞基因表达谱水平上的差异,并筛选肺癌外周血白细胞特异性基因,用于区分肺癌患者和健康人。材料和方法:本部分研究收集了 73例肺癌患者外周血样本和76例健康人外周血样本,并利用二代测序技术对这些样本的白细胞表达谱进行了检测。数据质控和标准化后,首先利用T分布随机近邻嵌入和非监督聚类算法根据样本的基因表达谱特征进行样本间比较。接下来通过分子距离分析和KW检验对不同病理类型的肺癌患者的外周血白细胞基因表达谱进行比较。随后用非配对t检验和差异倍数方法获得肺癌患者和健康人外周血白细胞的差异表达,利用功能富集对差异基因的生物学功能进行注释,并通过构建共表达网络,识别其中的核心基因。通过分析肺癌患者和健康人血常规结果比较两者外周血细胞构成比变化。进一步利用SVM-RFE算法识别肺癌外周血白细胞特异性标签并构建了分类模型,并随后在包含102例肺癌患者外周血样本和63例健康人外周血样本的独立验证数据集里对该分类模型的预测效率进行了评估。结果:基因表达谱比较结果显示,肺癌患者与健康人的外周血白细胞基因表达谱具有明显的差异,并且具有不同的分类特征,同时肺癌患者间的外周血白细胞表达谱也存在区别。进一步分析表明,肺腺癌、肺鳞癌和小细胞肺癌这三种不同病理类型肺癌的外周血白细胞基因表达谱间并没有显著的差异(单因素方差分析,p = 0.866)。根据基因表达谱特征肺癌患者可分为两类(分别被命名为Cancer1和Cancer2),两类肺癌在病理类型构成上没有显著区别(卡方检验,p= 0.8572),但在患者TNM分期分布上差异显著(卡方检验,p = 0.004248):Cancer1组以早期肺癌为主(70.6%),Cancer2组多为晚期肺癌(75%)。Cancer1组和Cancer2组两类肺癌与健康人间差异表达的生物学功能差异明显,并且Cancer2组外周血白细胞数量、外周血中性粒细胞比率和绝对值显著高于Cancer1组和健康人组(单因素方差分析,p<0.001),表明Cancer2组患者可能处于一种相对明显的炎症状态。以肺癌患者与健康人间的差异表达基因为基础,我们利用SVM-RFE算法找到了一组由22个基因组成的肺癌外周血白细胞特异性标签并利用该标签构建了分类模型。在独立验证数据集里,我们评估该分类模型的预测效率,结果显示,该模型可以很好的区分肺癌患者和健康人,精确度达到90.0%,灵敏度为92.1%,特异度为88.9%。结论:肿瘤与宿主免疫系统的相互作用使得肿瘤患者外周血白细胞表达谱发生明显变化。这些改变不仅为了解肿瘤如何影响机体免疫系统提供了研究线索,还为肿瘤相关辅助诊断标志物的研发提供了新的候选指标。第二部分三阴性乳腺癌预后相关因子NCAPD2的研究背景:在我国乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤,且发病率和死亡率呈逐年上升趋势。其中三阴性乳腺癌占到了全部乳腺癌发病总数的15%-20%,尽管比例不高,但与其他类型乳腺癌相比,三阴性乳腺癌复发快、预后差。三阴性乳腺癌具有侵袭性表型、分子异质性高以及缺乏靶向治疗的特点,因此在临床上是一类非常难治疗的疾病。三阴性乳腺癌患者有较高的局部复发和远处转移风险,导致预后不良。因此,研究三阴性乳腺癌发病的分子机制以及发掘潜在的三阴性乳腺癌预后相关标志物和治疗靶点,在临床上十分重要。NCAPD2(Non-SMC condensin I complex subunit D2)是condensin I复合体的关键组分之一,介导复合体在染色质上的募集和定位,主要参与细胞周期过程中染色体的凝集和分离。NCAPD2与人类疾病关系方面研究有限,我们首次报道了 NCAPD2与三阴性乳腺癌间存在的密切关系。目的:本课题旨在研究NCAPD2作为三阴性乳腺癌预后相关因子的价值,及其在促进疾病进展中发挥的生物学功能。材料和方法:利用免疫组织化学染色的方法,在179例三阴性乳腺癌患者肿瘤组织中检测NCAPD2的表达情况,并利用卡方检验和对数秩检验分析其与患者临床特征及预后的关系。利用相关性分析和功能富集对METABRIC(Molecular Taxonomy of Breast Cancer International Consortium)项目中299例三阴性乳腺癌样本的mRNA表达谱数据进行分析,用来了解NCAPD2在三阴性乳腺癌中发挥的生物学功能。进一步通过三阴性乳腺癌NCAPD2低表达细胞模型对数据分析了解到的NCAPD2功能进行验证。利用CCK-8实验和transwell实验检测NCAPD2对三阴性乳腺癌细胞增殖和侵袭的影响,并利用流式细胞术检测细胞周期的变化以及细胞的凋亡水平。结果:免疫组化结果显示,NCAPD2蛋白的表达主要定位于三阴性乳腺癌细胞的细胞质。统计分析和生存分析显示,NCAPD2蛋白的阳性表达与淋巴结转移密切相关(卡方检验,p = 3.84E-06),并且是三阴性乳腺癌独立的预后不良因素(多因素cox回归,p = 0.025),与三阴性乳腺癌患者较差的总生存(Log-rank检验,p = 0.0033)和无进展生存(Log-rank检验,p = 0.0013)显著相关。相比于NCAPD2蛋白阴性表达组患者,NCAPD2蛋白阳性表达组患者的三阴性乳腺癌相关死亡风险升高了5倍,疾病进展风险升高了4倍。基因表达谱数据显示,NCAPD2在三阴性乳腺癌细胞中参与了包括细胞周期、细胞增殖、细胞分裂和侵袭等多种与肿瘤恶性表型密切相关的生物学功能。NCAPD2低表达三阴性乳腺癌细胞模型验证了NCAPD2对细胞增殖能力和侵袭能力的影响,并发现抑制NCPAD2蛋白的表达会导致细胞发生G2/M期阻滞,从而使得部分细胞无法顺利完成有丝分裂变为多倍体细胞或发生细胞凋亡。结论:本研究第一次报道了NCAPD2与三阴性乳腺癌间存在的密切关系。发现NCAPD2在三阴性乳腺癌细胞的细胞周期、细胞增殖以及侵袭功能中扮演着重要角色,与三阴性乳腺癌的恶性表型具有密切联系。临床特征分析表明,NCAPD2蛋白阳性表达与三阴性乳腺癌的淋巴结转移程度相关。更为重要的是,NCAPD2蛋白阳性表达是三阴性乳腺癌独立的预后不良因素。