文昌鱼属于头索动物，是与脊椎动物亲缘关系最近的无脊椎动物。近年来，对文昌鱼的研究越来越受到国际学术界的重视。其研究内容涉及基因组、发育和免疫生物学等不同的领域，进展十分迅速。其中与脊椎动物免疫反应受体多样性相关重要分子的原始形式VCBP(Variableregion-containingchitin-bindingprotein)、与VDJ重排相关基因RAGI、补体系统的主要成员、淋巴样细胞以及免疫细胞凋亡、信号转导、模式识别等关键分子的发现已引起学术界的高度关注;加之佛罗里达文昌鱼基因组的基本完成，使文昌鱼成为研究脊椎动物免疫系统起源与进化以及探讨无脊椎动物和脊椎动物免疫系统演化关系的理想模型。　　 本文旨在通过对文昌鱼中免疫相关基因的研究探索脊椎动物免疫应答系统在进化中的保守性和特异性。本文以青岛文昌鱼和佛罗里达文昌鱼为研究材料，运用生物信息学、免疫学、分子生物学和细胞生物学等研究方法，对文昌鱼中可能参与免疫应答的几个基因进行鉴定和功能研究。特别针对基质金属蛋白酶(MMP)BbMMPL2的的自水解机制及其诱导凋亡的机制进行探索，从而揭示成体文昌鱼利用MMP应对细菌冲击可能的应答方式。另外，我们还探讨了文昌鱼中TGFβ-SMAD信号通路可能在免疫应答中的作用。　　 MMP主要负责胞外基质(ECM)的降解，从而在细胞的迁移、分化和组织重建等方面发挥作用。但越来越多的研究表明，除了降解ECM，MMP还能利用其自身的水解酶活性激活其他分子，如细胞因子和趋化因子等，从而直接或间接地参与癌症进程、炎症反应或免疫应答等。通过信息学分析筛选，我们最终确定文昌鱼中至少有21种不同的MMP，并按照结构特征将其进行分类、进化分析及功能预测。文昌鱼中的MMP家族成员包括基本型MMP、Ⅰ型跨膜MMP、GPI锚定MMP、分泌型MMP、胶原蛋白酶和基质溶素类MMP，还有很多与脊椎动物MMP并不完全相同的MMP;另外，我们还发现了具有TPR结构域的MMP，这在脊椎动物和无脊椎动物中都是没有的。但是文昌鱼中并未发现明胶型MMP和Ⅱ型跨膜MMP的同源物。文昌鱼中MMP的进化分析表明，MMP的催化域是最原始的结构组分，C端结构域及弗林酶识别位点等都是在进化中的进一步修饰和完善产生的。文昌鱼的MMP大部分属于基本型和膜型MMP，暗示这两类可能是较古老的MMP，是在物种分化(divergence)之前出现的。　　 我们已在成体文昌鱼中成功克隆到的三个MMP家族成员，命名为BbMMPL2、Bf-MMP17和Bf-MMP28，分别属于基本型、膜型和分泌型MMP。这三个基因在成体文昌鱼中广泛分布;大肠杆菌冲击后BbMMPL2转录上调，但对金葡菌的冲击变化不大;Bf-MMP28在金葡冲击后表达上调，但对大肠杆菌应答不明显;而Bf-MMP17在两种菌刺激时转录水平均无变化。这表明BbMMPL2和Bf-MMP28可能在免疫应答中发挥作用，并且对不同性质的细菌应答方式并不相同。我们利用大肠杆菌体系表达了BbMMPL2重组蛋白，并对酶活性进行了鉴定。在蛋白复性过程中我们发现BbMMPL2可以自水解;这种自水解是钙离子依赖的，并且是酶原获得活性所必需的。酶原以分子内和分子间切割的方式进行自水解;水解酶活性可以被金属螯合剂EGTA和MMP广谱阻抑剂GM6001所抑制。点突变E204A也可完全抑制自水解的进程。另外，Met60-Tyr82对酶原快速激活是必须的;BbMMPL2的C端结构域也参与酶原无活性状态的维持;连接域对重组蛋白的复性折叠是必须的。BbMMPL2重组蛋白表达中可通过分子间和分子内二硫键形成二聚物和寡聚体;但并不影响自水解进程。水解终产物可降解明胶、Ⅳ型胶原、酪蛋白和纤维蛋白原，但不能降解纤连蛋白、层粘连蛋白和α1-PI。这些结果表明，文昌鱼中的MMP不仅在一级结构上与脊椎动物和其他无脊椎动物一致，在降解ECM和激活方式上也相似。由于没有可用的文昌鱼细胞系，我们在哺乳动物细胞系中表达了pro-BbMMPL2重组蛋白，并发现该蛋白凝聚分布在细胞质中;而有活性的BbMMPL2重组蛋白在细胞质中均匀分布，并诱导细胞凋亡;点突变使酶失活后细胞凋亡的比例下降。这表明细胞的凋亡是与BbMMPL2的酶活性相关的。有研究表明细胞可通过自杀，即凋亡来减少细菌负担。我们认为，文昌鱼MMP也可通过类似的机制应答细菌冲击。　　 组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP)是MMP的内源阻抑剂。MMP与TIMP的平衡是维持正常生命活动所必须的;打破这一平衡将导致与ECM代谢紊乱、炎症、细胞生长和迁移有关的疾病，如关节炎、心血管疾病、癌症、神经紊乱和组织溃烂等。文昌鱼中有两个TIMP同源基因，Bf-TIMP1和Bf-TIMP2b;而在人中TIMP的数量为四个。TIMP在成体文昌鱼的各组织都有表达;Bf-TIMP1在大肠杆菌冲击后表达上调，对金葡菌没有应答;而Bf-TIMP2b的转录在两种细菌冲击过程中均无变化。这说明Bf-TIMP1可能参与了革兰氏阴性菌刺激的免疫应答。我们未能成功在体外表达这两种蛋白。诱导表达过程中大肠杆菌生长异常，因此我们推测可能是TIMP的表达导致大肠杆菌生长被抑制，甚至死亡。　　 我们还对文昌鱼中的TGFβ-SMAD信号通路进行了初步研究。TGFβ-SMAD信号通路是重要的研究生命生长发育的通路。近来有研究指出，该信号通路也参与免疫途径。TGFβ-SMAD信号通路中的组分和传导系统相对其他免疫路径简单得多，如NF-kB信号通路等，只需要配体-受体相互作用、磷酸化激活、转入细胞核等就可调控靶基因的转录。较少的组分参与使得该信号通路成为我们选择进行免疫应答研究平台的首选。　　 利用生物信息学手段我们在文昌鱼中分别找到了TGFβ、TGFβ受体、R-Smad和Co-Smad这些构成TGFβ-SMAD信号通路所必须的组分的同源基因。我们还找到了I-Smad及该通路中的辅助转录因子的同源物。在对这些同源物进行进化分析时我们发现，文昌鱼中的这些蛋白相对简单，并没有异构体的分化。如只有一个TGFβ和R-Smad;而在脊椎动物的该通路中通常具有1-3个TGFβ和2个R-Smad（Smad2和Smad3），分工更细。这些都说明文昌鱼中具有完整并保守的TGFβ-SMAD信号通路。　　 我们对这些基因进行了分离，并发现细菌冲击后Bf-TGFβ、Bf-TβRⅠ、Bf-Smad2、Bf-Smad4、Bf-Smad6和co-factorBf-SnoN基因转录都有不同程度的上调，只有TβRⅡ变化不大。这说明TGFβ-SMAD信号通路很可能参与了免疫应答。另外，为了研究该通路的作用机制，我们筛选了几个下游靶基因并进行了检测。其中iNOS基因在免疫冲击后转录增加，2h后转录开始下调。我们推测Bf-iNOS基因可能是受到TGFβ-SMAD信号通路的抑制:但具体的作用机制还需要我们未来更细致的体内实验进行证明。为此，我们还在体外表达了各媒介物的重组蛋白，为将来首先在体外检测受体-配体、Smad与co-factor之间的相互作用及制备抗体奠定基础。　　 通过本文的研究，我们第一次对文昌鱼中的MMP家族成员进行了分类，首次鉴定了BbMMPL2的生化性质并提出其可能诱导细胞凋亡的机制。BbMMPL2自水解机制的研究为其可能参与免疫应答的方式提供参考。我们还第一次提出文昌鱼中存在简单并保守的TGFβ-SMAD信号通路，并且该通路可能也参与细菌冲击的免疫应答。通过我们的研究，希望阐述文昌鱼中可能存在的免疫应答模式及在演化中的保守性和特异性。