背景与目的：肾细胞癌是起源于肾实质泌尿小管上皮细胞的恶性肿瘤,是泌尿系统中恶性度较高的肿瘤,也是最常见的肿瘤之一,占肾脏原发性肿瘤的85%-90%,其中80%-90%为透明细胞癌(Clear Cell Renal Cell Carcinoma),并且其发病率近年来呈上升趋势。由于肾透明细胞癌的发病机制尚不清楚,其早期临床表现常不典型,故有近一半的患者在发现时已处于肾癌晚期或发生远处转移而丧失手术机会。同时肾癌对放疗和化疗均不敏感；而免疫治疗的疗效有限,故其最主要治疗方法是手术切除术,但术后复发率达25%-50%。总的来说,药物和手术对于肾细胞癌患者无进展生存期和总生存率依然不尽人意。缺乏特异性分子标记物和有效地治疗靶点是目前肾癌诊治过程中所面临的难题和关键。因此,肾透明细胞癌临床诊断方式的突破及治疗方法的改善有赖于基础研究的重大进展,有赖于对肾透明细胞癌发生机制的阐明。越来越多的证据表明,RNA的选择性剪接作为一个广泛存在的生物进程,在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用。其中,核不均一核糖核蛋白家族(hnRNPs)因具有选择性剪接作用而在肿瘤发生中占据重要位置。核不均一核糖核蛋白L(hnRNP L)作为hnRNPs家族中的一员,近几年在肿瘤中的研究相继开展,但是有关hnRNP L在肾透明细胞癌中的表达情况及其功能调控机制研究在国内外尚无公开报道。核内不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,hnRNP)是存在于细胞核中的一类RNA结合蛋白,到目前为止已发现大约20多种hnRNPs(A-U)蛋白,现已发现多种hnRNPs蛋白在肿瘤的发生、发展中起着重要的作用。核不均一蛋白L (hnRNP L)是由Pinol-RomaS[21]等在早期转录片段中发现的富含胱氨酸及脯氨酸的核糖核蛋白,是核不均一核糖核蛋白(核蛋白)复合体的一个重要组成部分。HnRNP L作为RNA结合蛋白,参与染色体重塑、转录、翻译的调控以及信号转导过程,在肿瘤发生发展中的作用越来越引起重视。已有的生物信息学分析也显示hnRNP L与hnRNPs家族数个成员是功能伴侣(function partner). Pubgene分析提示hnRNPL与细胞的凋亡、死亡和生长等生物学进程密切相关。近年来相继有hnRNP L在肿瘤中的研究报道,证实hnRNP L可能通过影响mRNA前体剪接参与肝癌、肺癌、转移性结直肠癌和食管鳞状细胞癌等肿瘤发生,但其分子机制及可能涉及的信号通路尚未完全清楚。从已发表的文献中未见hnRNP L在肾透明细胞癌中的作用机制研究,但是hnRNP L在其他相关领域中的机制研究已有报道。它可能通过以下机制起作用：1.mRNA前体剪接作用：hnRNP L通过与caspase-9前体mRNA结合调控肺癌细胞的侵袭力；同时hnRNP L也参与CEACAM1癌胚抗原相关细胞黏附分子1)前体mRNA的选择性剪接；2.受IRES(内部核糖体进入位点序列)调节：IRES为非编码RNA,折叠成类似于起始tRNA的结构,从而介导核糖体与RNA结合,起始蛋白质翻译。有文献报道,hnRNP L发挥作用依赖于HCV-IRES活性;3.逆转录调控：hnRNP L可以作为主要影响因素通过结合LINE-1(长分散元件)RNA参与逆转录调控；4.与miRNA相互作用：Jafarifar等发现有4种短链非编码RNA(miRNA)结合在VEGFA(血管内皮生长因子)3’-非编码区的顺式作用元件上,而hnRNP L同样结合于此区域,并且可以抑制miRNA的沉默作用。近期有研究表明：lncRNA-THRIL和hnRNP L形成的功能复合体可以与TNF α启动子区域结合,通过调节Toll受体信号通路中的髓样分化因子MyD88,达到调控TNFα基因转录的作用。该研究提示lncRNA及其结合蛋白在人类先天性免疫缺陷以及感染的发生中发挥重要作用。长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA)是一类转录本长度超过200nt、不编码蛋白的RNA。IncRNA起初被认为是基因组转录的“噪音”,不具有生物学功能。然而,近年来的研究表明lncRNA能在表观遗传、转录及转录后水平上调控基因表达,参与了X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的调控过程,与人类疾病的发生、发展和防治都有着密切联系。虽然近年来关于IncRNA的研究进展迅猛,但是绝大部分的IncRNA的功能仍然是不清楚的。随着研究的推进,各类IncRNA的大量发现,IncRNA的研究已经成为RNA研究的新领域。HnRNP L与肿瘤发生发展的关系已明确,然而到目前为止,其在肾透明细胞癌中的发生发展中的功能及其分子调控机制仍存在许多待阐明的重要问题。HnRNP L参与的信号通路至今尚不清楚；阐明hnRNP L基因的表达调控机制是明确其在肿瘤发生发展中作用的重要基础。本研究的开展有助于发现肾细胞癌致病机理；为临床肾透明细胞癌的早期诊断、治疗及预后判断提供新的分子标志物。研究方法：(1)每例肾透明细胞癌切取约3mm×5mm大小组织,取材后立即置入冻存管中,放入液氮中保存。根据病理诊断结果初步分为肾透明细胞癌组和正常肾脏组织组。免疫组化检测两组样本中hnRNP L的表达强度。染色表达评分方法根据染色强度和阳性细胞数比例两项指标进行综合评判。应用Western blot验证hnRNP L蛋白在肾透明细胞癌组织和癌旁非肿瘤组织中的表达。然后应用统计学分析hnRNP L表达与患者临床参数(包括：年龄、性别、肿瘤体积、TNM分期、病理分期、组织学分级等)与之间的相关性。(2) HnRNP L蛋白在肾透明细胞癌中的表达与患者预后的关系,Kaplan-Meier法分析hnRNP L表达同患者生存时间之间的关系。此外,我们对hnRNP L检测的敏感度及特异度进行统计学分析,判定其是否可作为肾透明细胞癌诊断的分子标记物。(3)课题组另外成员已开始研究hnRNP L的功能,本人前期通过采用Arraystar Human LncRNA Microarray V3.0芯片,比较了敲低hnRNP L的肾癌SN12-PM6细胞与对照细胞lncRNA及mRNA的基因表达谱差异,初步分析hnRNP L在肾透明细胞癌中的可能调控机制。结果：(1)HnRNP L蛋白在90例肾透明细胞癌组织和癌旁非肿瘤组织中的表达有差异,在肿瘤中为低表达,hnRNP L蛋白主要表达于细胞核内,呈弥漫性分布。HnRNP L蛋白在肾透明细胞癌组织中阳性表达率为71.1%(64/90)；在肾透明细胞癌组织中hnRNP L蛋白显色的阳性细胞数及显色强度较癌旁非肿瘤组织明显减少,在少数癌旁非肿瘤组织中呈阴性表达,阳性表达率为98.9%(89/90),两者比较,差异具有统计学意义(P<0.05)；(2)90例肾透明细胞癌患者组织中,hnRNP L蛋白的表达与T分期、组织分级、临床分期及肿瘤大小密切相关；其中,T1a、T1b和T2-T3期hnRNP L蛋白的阳性表达率分别为88.9%(32/36)、76.7%(23/30)和37.5%(9/24),组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。组织学分级为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ患者中,hnRNP L蛋白的阳性表达率分别为80.9%(38/47)、53.6%(15/28)和73.3%(11/15),组间比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。临床分期为1期和2期患者中,hnRNP L蛋白的阳性表达率分别为83.1%(54/65)和40.0%(10/25),组间比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。肿瘤大小中(≤178,>178),hnRNP L蛋白的阳性表达率分别为82.0%(50/61)和48.3%(14/29),组间比较差异有显著性(P<0.05)。然而,hnRNP L蛋白表达与患者年龄无明显相关性；(3) Kaplan-Meier法分析显示hnRNP L低表达患者的生存时间显著低于其高表达患者,hnRNP L低表达患者总生存时间(37.75±4.904)较短,hnRNP L高表达患者总生存时间(68.483±3.286)较长,差异具有统计学意义(LogRank=30.18,P=0.000)(粗线代表hnRNP L低表达组；虚线代表hnRNP L高表达组)。InRNP L阳性组患者5年生存率75.0%(95%CI,64.024%,85.976%),然而hnRNP L阴性患者的5年生存率仅有20.8%(95%CI,4.532%37.068%)；对肿瘤体积小于178cm3的患者生存时间数据分析显示在小体积肾癌中hnRNP L的差异表达患者生存时间也会产生显著差异(P<0.001)；对组织学分级在Ⅰ期的患者生存时间数据分析显示Ⅰ期的早期肾癌中hnRNP L的差异表达患者生存时间也会产生显著差异(P<0.001);组织学分级在Ⅱ-Ⅲ期的患者同样有显著差异(P=0.007)；临床分期Ⅰ的患者差异也较为显著(P<0.001)；TNM分期中的pT分期为Ⅰ期的患者差异同样显著(P<0.001)；多因素Cox风险比例模型分析显示：hnRNP L是影响肾透明细胞癌患者预后的独立危险因素(P=0.009)；(4)对差异lncRNA/mRNA进行了交集分析,在全部33000个LncRNA和30200个基因探针中,筛选出了hnRNP L表达水平相关的差异LncRNA 4506个(上调2178个,下调2328个),mRNA 3781个(上调2488,下调1293个)。结论：(1)HnRNP L蛋白在人肾透明细胞癌中的表达水平显著低于癌旁非肿瘤组织,且与肾透明细胞癌病理参数呈负相关,其表达水平的下降提示患者更差的预后；(2)HnRNP L可能作为肾透明细胞癌患者预后的独立危险因素：(3)HnRNP L与肾透明细胞癌发生存在联系,其可能作为肾透明细胞癌患者早期诊断和预后评估的分子标志物。(4)HnRNP L可能通过与lncRNA的相互作用参与肾透明细胞癌的发生。