论文部分内容阅读
目的:通过分析对AS患者外周血CD4+、CD8+T细胞TCR BV CDR3谱型多样性特点及检测TCR二次重排的相关基因,探讨TCR CDR3氨基酸序列和TCR二次重排与AS发病的相关性,为AS中T细胞致病机制的研究和个性化治疗提供一条新的途径。方法:(1)免疫磁珠法分离AS患者与健康对照组外周血中的CD4+、CD8+淋巴细胞。(2)提取各样本总RNA并按RT-PCR Kit操作说明书逆转录合成c DNA。(3)参照文献设计并合成TCR BV亚家族及实验对照引物,RT-PCR法扩增各样本TCR亚家族,并用2%琼脂凝胶电泳鉴定PCR产物。(4)免疫扫描技术分析PCR产物,并用将单/寡克隆基因进行测序,分析AS患者CD4+、CD8+TCR BV家族CDR3区谱系多态性及克隆性的特点(5)RT-PCR法检测各样本RAG1、RAG2、Td T、Ku70、Ku80表达情况,同时检测TCR重排过程中间产物BD2-BJ2重排删除环。结果:(1)健康对照组及AS患者CD4+、CD8+TCR BV各家族PCR产物在2%琼脂糖凝胶电泳图显示,各家族均有表达。正常健康人CD4+、CD8+TCR BV亚家族免疫扫描均呈正态分布。(2)12例AS患者CD4+TCR BV家族绝大多数呈现与健康对照相似的正态分布的钟型峰图,仅少数家族呈不规则异常峰型或偏峰,极少家族出现寡克隆趋势,仅2例患者各出现1个单克隆家族单峰。不同患者的CD4+TCR BV家族异常峰型率在4%(1/26)~27%(7/26),异常率出现较高的家族有BV 2和BV 3均为75%(9/12),BV 19为50%(6/12),异常率较低的家族为BV 9和BV 13.2均为8.3%(1/12)。(3)12例AS患者CD8+TCR BV家族大多数呈现非正态异常峰型,其中7例患者CD8+TCR BV家族异常分型率高于50%以上,明显多于CD4+T细胞。AS患者CD8+TCR BV 26个亚家族均出现异常峰率,其中异常率较高的家族为BV 3和BV 19均为83%(10/12),异常率较低的家族为BV 8为17%(2/12)。(4)同一患者出现不同BV亚家族单克隆增生,其TCR BV CDR3区长度和序列有所不同。同一BV亚家族在不同患者其CDR3区长度和序列也不相同。显示同时存在一些共同基序。(5)6例AS患者治疗前后CD8+TCR BV亚家族异常率均高于治疗前后CD4+T细胞,其中3例患者治疗后CD4+TCR BV亚家族异常率下降,4例患者CD8+TCR BV亚家族异常率均下降。(6)20例健康对照、病例对照组及AS患者RAG1、RAG2、Td T、Ku70、Ku80PCR产物在2%琼脂糖凝胶电泳图显示,AS患者、正常健康对照组均表达Ku70;8例AS患者、3例正常健康检测到Ku80的特异性条带。其他条带未检测出。(7)16例正常对照检出BD1-BJl sj TRECs S1,AS患者均未检出sj TRECs。结论:(1)AS患者CD4+、CD8+TCR BV CDR3谱系存在显著多态性,CD8+T细胞在AS患者的免疫发病机制中占据主导地位。(2)AS患者治疗前后CD4+、CD8+TCR BVCDR3谱系的监测,有可能成为了解患者病情进展状况,间接反映疗效和预后的一种新的有效技术手段。(3)AS患者外周TCR不存在二次重排,AS患者TCR BV家族的异常改变可能并非由TCR二次重排而形成。