邻苯二甲酸酯类物质在工业生产活动中主要用作聚氯乙烯树脂、粘附剂和纤维素膜的增塑剂，广泛存在于人类日常生活用品中。随着社会经济的发展，儿童性早熟越来越引起关注和重视。流行病调查发现性早熟与接触邻苯二甲酸酯有关联。目前虽有邻苯二甲酸酯暴露对成年雌性大鼠生殖毒性的报道，但是关于新生期和青春前期低剂量暴露对雌性青春期发育影响的研究较少。本课题采用雌性大鼠动物模型，以阴道开口时间（雌性大鼠进入青春期的标志）为观察终点，同时观察各个阶段大鼠体重和肛门生殖器距离（AGD），发情周期变化，卵巢重量变化和各级卵泡数目变化，研究对雌性大鼠生殖功能的影响；采用青春前期大鼠下丘脑离体培养模型，以下丘脑内各关键基因mRNA表达为观察终点，观察DEHP/DBP对下丘脑kisspeptin/GPR54的表达的影响，以血清激素水平、大脑中关键基因和蛋白表达为终点，研究新生期和青春前期暴露DEHP/DBP通过Kisspeptin/GPR54系统影响生殖内分泌的机制。第一部分新生期和青春前期暴露DEHP/DBP对雌性大鼠青春期生殖发育的影响目的利用雌性大鼠动物模型，研究新生期和青春前期邻苯二甲酸二丁酯（DBP）和邻苯二甲酸乙基己基酯（DEHP）暴露，对雌性大鼠青春发育以及生殖功能的影响。方法（1）建立大鼠模型：雌雄SD大鼠交配后，孕鼠所生雌性子鼠经过窝别的交换后随机分为：1.新生期(出生后第1-5天，PND1-5)给药组：芝麻油对照组、0.1mg/kg E2组、0.5、5和50mg/kg DBP组、0.5、5和50mg/kg DEHP组。2.青春前期（出生后26-30天，PND26-30）给药组：芝麻油对照组、0.1mg/kg E2组、0.5、5和50mg/kg DBP组、0.5、5和50mg/kg DEHP组。（2）观察子鼠一般发育状况：不同时间点体重变化。（3）观察子鼠性分化状况：不同时间点肛门生殖器距离（AGD）变化。（4）观察子鼠青春期性发育和生殖功能状况：阴道开口时间，发情周期变化、血清激素水平、卵巢脏器系数、卵泡数目和结构。结果1. E2暴露对雌性大鼠青春期生殖发育的影响（1）新生期0.1mg/kg E2暴露后，大鼠的体重在第15天显著性的下降，但是在之后的生长过程中逐渐的增加，在第25和35天跟对照组没有显著性差异。青春前期E20.1mg/kg暴露后,大鼠第35天体重没有显著性的改变。（2）新生期0.1mg/kg E2暴露对大鼠体重normalizedAGD没有显著性的影响，但在第35天观察到大鼠nomalizedAGD有增加的趋势。青春前期0.1mg/kgE2暴露后,大鼠第35天normalizedAGD没有显著性的改变。（3）0.1mg/kg E2暴露，与对照组相比，大鼠阴道开口时间显著性的提前。两个暴露阶段对大鼠阴道开口时间没有显著性的影响。（4）0.1mg/kg E2暴露，大鼠发情周期长度增加，发情周期各阶段顺序紊乱。（5）0.1mg/kg E2暴露显著性的增加雌性大鼠血清雌激素水平，新生期暴露组大鼠血清雌激素水平高于青春前期暴露组。（6）新生期和青春前期大鼠0.1mg/kg E2暴露对大鼠黄体生成素（LH）没有显著性的影响。（7）0.1mg/kg E2暴露，大鼠卵巢/体重没有显著性的改变，同时各阶段卵泡数目也没有变化。2. DBP暴露后对雌性大鼠青春期生殖发育的影响（1）新生期DBP暴露后，与对照相比，在第15天0.5、5和50mg/kg DBP组大鼠的体重显著性增加，在第25天0.5和50mg/kg DBP组雌性大鼠体重显著性的增加，在第30天50mg/kg DBP组大鼠体重显著性的增加。青春前期DBP暴露后，与对照组相比，在第35天各个组大鼠体重增加不显著。（2）新生期DBP暴露后，与对照相比，在第15天5和50mg/kg DBP组雌性大鼠nomalized AGD减小，在第25天0.5和5mg/kg DBP组大鼠nomalizedAGD显著性的增加，在第35天0.5和50mg/kg DBP组大鼠nomalized AGD显著性的增加。青春前期DBP暴露后，第35天各组大鼠nomalizedAGD没有显著性的改变。（3）DBP暴露后，与对照组相比，各个组大鼠阴道开口时间显著性的提前，并且暴露的两个阶段对大鼠阴道开口时间没有显著性的影响，但暴露阶段和DBP间有交互作用，共同影响阴道开口时间，其中PND1-50.5mg/kg DBP和PND26-305mg/kg DBP组，大鼠阴道开口时间提前最为显著。（4）与对照组相比，0.5和50mg/kg DBP组大鼠发情周期的长度显著性增加，并且青春期暴露组比新生期暴露组延长，其中PND26-300.5（all p<0.01）和50mg/kg (all p<0.05)DBP两组大鼠发情周期比其他所有组都延长。发情周期的各个阶段顺序紊乱，不能形成规律的发情周期变化。（5）DBP暴露后，0.5mg/kg组雌性大鼠血清雌激素水平显著升高，暴露阶段和DBP对大鼠血清激素水平有交互作用，其中P26-300.5mg/kg DBP显著高于其他组。（6）DBP暴露后，与对照组相比，0.5、5和50mg/kg组雌性大鼠血清LH水平虽然没有显著性的差异，但是呈上升趋势。（7）DBP暴露后，5和50mg/kgDBP组大鼠卵巢/体重显著性的增加，但各阶段卵泡数目没有显著性的改变，没有观察到明显的病理变化。3. DEHP暴露对雌性大鼠青春期生殖发育的影响（1）新生期DEHP暴露后，与对照组相比，第15和25天0.5、5和50mg/kgDEHP组大鼠体重显著性的增加，第35天5和50mg/kgDEHP组大鼠体重显著性的增加。青春前期DEHP暴露后，与对照组相比，第35天5和50mg/kgDEHP组大鼠体重显著性的降低。（2）新生期DEHP暴露后，与对照组相比，第150.5、5和50mg/kg DEHP组大鼠normalized没有显著性的改变，第25天50mg/kgDEHP组大鼠normalizedAGD显著性的增加，而第35天5mg/kg DEHP normalized AGD显著性的降低。青春前期DEHP暴露后，与对照组相比，第35天0.5mg/kg DEHP组大鼠normalized AGD增加。（3）DEHP暴露后，雌性大鼠阴道开口时间没有显著性的影响，并且两个阶段暴露对大鼠阴道开口时间也没有显著性的影响，但PND26-305mg/kg DEHP组大鼠阴道开口时间比其他组推迟。（4）DEHP暴露后，大鼠发情周期长度显著性的增加，发情周期的各阶段顺序紊乱，不能形成规律的发情周期变化。（5）DEHP暴露后，雌性大鼠血清雌激素水平没有显著性的改变，但与对照组相比较，0.5和5mg/kg DEHP组大鼠血清雌激素水平略有上升。两个暴露阶段对血清雌激素水平没有显著性的影响。（6）DEHP暴露后，雌性大鼠血清LH水平虽然没有显著性的改变，但与对照组相比较，0.5和5mg/kg DEHP组大鼠血清LH水平上升。（7）DEHP暴露后，50mg/kgDEHP组大鼠的卵巢/体重显著性的增加，两个暴露时间段对卵巢/体重没有显著的影响。各组大鼠卵巢内各种卵泡的数目没有显著性的改变，没有观察到病理变化。结论1. DBP和DEHP暴露能够增加雌性大鼠的体重和AGD，而随着大鼠的生长，增加体重和AGD的效应逐渐减弱。这两种物质对体重的影响与E2的效应不同，早期E2暴露会引起大鼠的体重降低和AGD减小，但这种效应随着大鼠的生长也逐渐减弱。DBP、DEHP和E2可能是通过不同的作用途径或方式影响大鼠一般生长发育以及性分化过程。与青春期暴露相比较，新生期暴露的影响更加的显著。2.新生期和青春前期DBP暴露，雌性大鼠进入青春期的时间显著提前，而之后的发情周期紊乱，发情周期的长度增加。新生期和青春前期DEHP暴露，雌性大鼠进入青春期的时间影响不显著，但发情周期也发生紊乱，发情周期的长度增加。说明DBP对雌性大鼠青春期发育的影响比DEHP强。两种物质的效应与E2类似，但没有其效应强。3.新生期和青春前期DBP和DEHP暴露，雌性大鼠卵巢/体重增加，虽然没有影响卵巢各级卵泡数目，也没有引起卵巢结构病理性变化，但短期暴露对生殖系统的影响应引起关注第二部分DEHP/DBP对下丘脑kisspeptin/GPR54系统的影响目的1.利用下丘脑体外培养模型，研究DBP和DEHP暴露能否作用于下丘脑，影响内分泌关键基因的表达。2.利用雌性大鼠模型，探讨新生期和青春前期DBP和DEHP暴露对雌性大鼠青春发育影响的机制。方法1.下丘脑组织短期暴露DEHP/DBP对kisspeptin/GPR54系统的影响（1）取青春前期雌性SD大鼠下丘脑，随机分为三组，培养基预培养1小时后，分别给予培养基对照，10-6M DBP、10-6M DEHP、10-7M E2，95%O2-5%CO2，37℃培养1小时。（2）收集培养后的下丘脑，提取RNA,经过反转后，利用RT-PCR技术检测GnRH、kisspeptin、GRP54、ERα mRNA的表达水平。2.新生期和青春前期暴露DEHP/DBP对雌性大鼠下丘脑kisspeptin/GPR54系统的影响（1）每组一部分大鼠取下丘脑AVPV和ARC区，提取RNA，经过反转后。利用RT-PCR技术检测kisspeptin、GRP54、ERα mRNA的表达水平。（2）每组其他部分的大鼠进行多聚甲醛灌注后取脑，用震动切片机将脑组织切成40μm厚度的脑片，进行免疫组化分析，检测AVPV和ARC区kisspeptin蛋白的表达水平。结果1.下丘脑组织短期暴露DEHP/DBP对kisspeptin/GPR54系统的影响与对照组相比，给予DBP和DEHP暴露后，下丘脑关键基因GnRH、kiss1和ERα mRNA表达水平显著性的降低，GPR54mRNA表达没有显著性的变化。2.新生期和青春前期暴露DEHP/DBP对雌性大鼠下丘脑kisspeptin/GPR54系统的影响2.1E2暴露对雌性大鼠下丘脑kisspeptin/GPR54系统的影响（1）新生期和青春前期0.1mg/kg E2暴露，影响下丘脑AVPV和ARC区kisspeptin、GPR54、ERα和ERβmRNA表达水平。在下丘脑AVPV区，新生期0.1mg/kg E2暴露，kisspeptin、GPR54、ERα和ERβ mRNA表达下调，青春前期0.1mg/kg E2暴露，kisspeptin、GPR54、ERα表达略有下调。在下丘脑ARC区，青春期暴露0.1mg/kg E2，kisspeptin、GPR54、ERα表达上调。（2）新生期0.1mg/kg E2暴露，下丘脑AVPV区免疫组化kisspeptin表达密度增加，下丘脑ARC区免疫组化kisspeptin表达密度略有下降。青春前期暴露0.1mg/kg E2下丘脑AVPV和ARC区免疫组化kisspeptin表达密度略有下降。2.2DBP暴露对雌性大鼠下丘脑kisspeptin/GPR54系统的影响（1）新生期暴露组，ARC区ERα、ERβ、GPR54mRNA表达下调，而在青春前期暴露组表达上调或者大体不变。新生期DBP暴露后，ARC区KisspeptinmRNA的表达上调，但是在青春前期DBP暴露后，其表达基本不变或者下调。在AVPV区，P1-50.5、5、50mg/kg DBP和P26-200.5mg/kg DBP组大鼠ERα、ERβ、GPR54mRNA表达上调或者不变，但在青春前期DBP暴露的高剂量组，大鼠kisspeptin、GPR54、ERβ mRNA表达下调或不变，而ERα mRNA表达上调。（2）新生期DBP暴露后，ARC区kisspeptin的表达密度上升，而在AVPV区kisspeptin表达密度上升。青春期DBP暴露后，在5和50mg/kg DBP组，ARC区kisspeptin的表达密度显著的下降，同时AVPV区也观察到kisspeptin表达密度下降。2.3DEHP暴露对雌性大鼠下丘脑kisspeptin/GPR54系统的影响（1）新生期和青春前期DEHP暴露后，AVPV区ERα、ERβ、GPR54mRNA在新生期暴露组表达没有显著性的改变；在青春前期，0.5和5mg/kg DEHP组表达下降或下降，而在50mg/kgDEHP组表达上升或不变。 ARC区ERα、ERβ、GPR54mRNA在新生期暴露组表达的下降，而在青春前期暴露组没有显著性的改变。对于kisspeptin mRNA。（2）新生期DEHP暴露显著性地影响kisspeptin的表达密度，其中5mg/kgDEHP组AVPV区kisspeptin表达密度显著性的高于对照组；在大鼠的ARC区，新生期DEHP暴露对kisspeptin的表达没有显著性的影响。青春前期DEHP暴露同样也显著性的影响kisspeptin的表达，其中5和50mg/kgDEHP组AVPV区kisspeptin表达密度都显著性的增加。0.5、5和50mg/kg DEHP组ARC区kisspeptin的表达密度比对照降低。结论DBP、DEHP和E2暴露，影响下丘脑GnRH、kisspeptin、GPR54、ERα mRNA表达水平。新生期和青春前期DBP、DEHP和E2暴露，主要影响下丘脑kisspeptin、GPR54mRNA的表达，对ERα和ERβ mRNA的表达略有影响。新生期和青春前期DBP暴露，kisspeptin mRNA和蛋白表达变化趋势一致，新生期和青春前期DEHP和E2暴露，kisspeptin mRNA和蛋白表达变化趋势略有不同。这些不同程度的变化趋势，可能是由DBP和DEHP存在非单调性的剂量反应关系以及新生期和青春前期暴露机体启动的修复和补偿方式不同引起的。下丘脑这些基因和蛋白的改变，进一步可能影响激素水平以及内分泌系统的反馈作用等，最终影响青春期生殖发育。