前言 近年来，无论是在动物实验研究，还是在临床研究中均发现，短暂性脑缺血预处理(Ischemic Preconditioning，IPC)或短暂性脑缺血发作均能诱导缺血耐受(Ischemic Tolerance，IT)的产生，而IT具有神经保护作用。目前有关一氧化氮(Nitric Oxide，NO)参与缺血性脑损伤中神经元损伤已获得了多方面的证据，提示NO在缺血性脑损伤的病理生理中起着重要作用。在缺氧缺葡萄糖的离体脑细胞缺血模型中，氧、葡萄糖缺少预处理诱导IT依赖NO和硝基精氨酸甲酯(NAME)受体的P21 ras的活化，一氧化氮合酶(NOS)抑制剂L-N精氨酸阻滞了氧、葡萄糖缺少诱导的IT，提示氧、葡萄糖缺少诱导的皮层神经元IT与NO诱导的Ras/细胞外信号传导蛋白激酶的活化有关，这就意味着NO参与了IT的形成。 本文采用线栓法制备预缺血局灶性Wistar大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型，通过比较不同缺血时间大鼠神经病理学评分和神经元病理形态改变，检测各组中神经元型一氧化氮合酶(nNOS)阳性细胞表达数目，来探讨IPC诱导IT过程中NO的作用、可能机制和IT形成的临床意义。 实验材料 实验动物：Wistar大鼠40只。主要实验仪器：双极射频电凝器、头盔式手术显微镜、4-0单股尼龙线、AO切片机、光学显微镜、温箱等。主要试剂：nNOS抗体。 实验方 法 1、动物模型的制备 40只成年Wistar大鼠，体重280－3209，入选实验，采用水含氯醛①5m少kg）腹腔注射麻醉，参考longa的插线方法，加以改良。颈总动脉切一小切口，将4－0单股尼龙线插人颈总动脉，缓慢推进约 17－22nun时，感到有轻微阻力时停止。此时，可观察到大鼠的呼吸明显改变。阻断血流一段时间后，后退尼龙线，关闭切口。大鼠在室温下p－25 T）自行苏醒。单次缺血组在术后 3天处死。第一次缺血再灌注3天后，大鼠再次麻醉，将尼龙线推进到上次深度，缺血一定时间后，后撤尼龙线，缝合切口。麻醉苏醒后再饲育3天后处死。 正常组大鼠不经手术，假手术组只是结扎右侧颈总动脉，插线深度＜mmm，饲育3天后处死。 实验阳性大鼠的标准为大鼠苏醒后，呈现右侧Horner氏征和左前肢麻痹或大鼠原位向左侧划圈，失败例数排除实验组。 2、病理标本制作 大鼠过量腹腔麻醉，以0．9％生理盐水和4％多聚甲醛心脏灌注，取脑后常规脱水，包埋，在视交叉前缘做冠状切片，分别行HE染色和免疫组织化学染色。 3、免疫组化染色过程 载玻片防脱片处理。切片常规脱蜡至水。蒸馏水新鲜配置3％HP＊室温10分钟。热修复抗原，滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。滴nNOS抗体（兔IgG入4℃过夜。滴加生物素化山羊抗兔lgG，室温20分钟，滴加试剂SABC，室温20分钟。DAB染色，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片。显微镜观察。4产经元损伤分级及NOS阳性神经元计数 本实验中神经元损伤分级如下对级：无神经元坏死；1级：散 ·2·在单个神经元坏死或小团细胞坏死；11级：散在的成团细胞坏死；皿级：几乎所有细胞都存在坏死。光学显微镜下门0 X 20）观察神经元病理形态改变。nNOS阳性神经元计数方法：光学显微镜下门0 X 20）在海马 CA；区计数 nNOS阳性细胞数。 结 果 1．大鼠缺血后神经病理学评分清况 大鼠缺血后神经病理学评分，是在缺血后24小时进行。10dn组为0－l级，30 dn组为二级，90 dn组为 2－3级，10min＋30ndn组为 3级，呈现明显的累积性损害，预缺血 30min＋90ndn组为1一二级，呈现明显的神经保护作用。正常组和假手术组为0级。 2、光镜下海马CA；区神经元缺血性改变 在光镜下月E染色切片上可见海马锥形细胞表现为肿胀或固缩，胞浆嗜碱染色且核皱缩，稍重者可见到嗜酸性变性细胞，胞核中染色质疏松，呈空泡状。神经毡疏松，周边水肿，炎性细胞浸润。最重者神经元坏死消失，残存无核的“鬼影”细胞，海马结构紊乱，甚至消失。正常对照组和假手术对照组大鼠脑组织在光镜下未见病变。 单次MCAO 10min＊0ndnJ0min组的神经元病变程度随着缺血时间延长而逐渐加重。单次缺血10ndn组，神经元主要表现为0八级，单次缺血30min组神经元主要表现为二一2级，而单次缺血叨in组，神经元表现为2－3级，以3级为主，各组间总体差异显著（方差分析：P＜0．01人相关各组之间均存在差异显著性＊检验：P＜0．of人 10min＋30ndn组神经元的病理改变呈 2－3级改变。预缺血 10min＋30drin组与单次缺血 30ndn组比较，两组间存在差异显著性瞩＜0．05入预缺血10而n＋30而n组呈现明显的 ·3·累积性损害。预缺血 30min＋90min组神经元表现为 1－2级改变，与单次缺血90min组相比存在差异显著性（P＜0．01入呈现明显的神经保护作用。 3、nLNOS阳性神经元的数目和染色强度 nNOS阳性神经元其活性强弱是以染色深浅来表达的，一般分为强、中、弱阳性。强阳性为