随着全球海水养殖业的飞速发展，鱼类病害问题带来的经济损失也日益严重。作为环境友好、稳定有效的疾病控制策略，免疫接种逐渐成为在现代水产养殖中的主流防治方法。近年来，以病原细菌的减毒株为活菌载体，通过外源蛋白呈递系统分泌表达各种病原微生物保护性抗原因子的多效价疫苗开发成为了新的研究热点。　　 在实验室前期工作中，从我国黄海海域暴发弧菌病的鱼体内分离得到鳗弧菌病原菌MVM425，并通过分子生物学手段开发得到鳗弧菌减毒活疫苗。在此基础上，本文进一步探索基于鳗弧菌内源性分泌途径的外源蛋白呈递系统，为鳗弧菌多效价载体疫苗的开发提供可行的技术平台。本论文尝试了两种实验方案来实现这一研究目标。　　 方案一是通过在基础质粒上对外源基因与Ⅰ型分泌系统信号肽序列及元件基因的框内整合来实现外源蛋白的分泌表达。本文采用基因走读的方法，克隆了鳗弧菌基因组上6kb的Ⅰ型蛋白分泌系统RTX基因簇，包含3个功能蛋白(酰基转移酶RtxC，ATPase蛋白RtxB，膜融合蛋白RtxD)以及毒素蛋白RtxA的N端部分。分别构建了rtxB和rtxC基因的插入失活突变株，对各突变株的胞外产物的分析结果表明RtxB和RtxC蛋白与鳗弧菌部分蛋白酶物质的分泌转运有关，揭示RTX基因簇在鳗弧菌中具有重要的蛋白分泌功能。由于未能成功克隆到被分泌蛋白RtxA的C末端信号肽编码序列，无法按该方案实现预期研究目标。　　 方案二是在不引入相关分泌元件蛋白的基础上，依靠宿主基因组上内源性的蛋白分泌系统功能蛋白及外源导入的信号肽来介导目的蛋白在宿主细胞中的表达及分泌。本文选取了4个Ⅰ型和Ⅱ型分泌系统的特征信号肽序列(大肠杆菌溶血素信号肽SPhlyA，霍乱弧菌RTX毒素蛋白信号肽SPrtxA，鳗弧菌溶血素信号肽SPvah3，鳗弧菌金属蛋白酶信号肽SPempA)，分别考察它们在鳗弧菌减毒株中对GFP报告蛋白、病毒蛋白(虹彩病毒MCP蛋白)及细菌蛋白(迟钝爱德华氏菌EseB蛋白、嗜水气单胞菌AopD和GapA蛋白)的分泌表达能。实验结果表明，来源于鳗弧菌的SPempA可介导所有外源蛋白进行稳定、高效的分泌转运，其余3个信号肽则因融合蛋白表达量较低或蛋白降解定等因素未能实现对目的蛋白的有效分泌表达。　　 以模式动物斑马鱼和经济鱼种大菱鲆为实验对象，进一步考察基于SPempA外源蛋白呈递系统构建的候选载体疫苗的实际应用效果。评价结果表明，两个候选株(分别分泌表达EseB和GapA)均保持了原减毒活疫苗对鳗弧菌的免疫抗原性，对鳗弧菌野生株具有很好的免疫保护力；同时，疫苗株在进入鱼体后可正常分泌表达目标抗原，激发鱼体产生相关免疫应答反应。两个候选株对于迟钝爱德华氏菌及嗜水气单胞菌的相对保护力均己接近纯蛋白EseB或GapA免疫所达到的保护效果。其中，分泌表达GapA蛋白的载体活疫苗AV(pGap-empA)，针对病原菌鳗弧菌和嗜水气单胞菌的相对保护率(RPS)分别可达84％和71％，具有良好的多效价保护效果，这也揭示了这项基于分泌信号肽的外源抗原呈递技术在多效价载体疫苗的开发中具有重要的应用价值。