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膀胱移行细胞癌(Bladder Transitional cell carcinoma,BTCC)是我国泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤,虽然70%~75%的初发肿瘤为浅表性,但术后易复发、易进展。自从1976年有学者首次报道应用卡介苗(Bacillus Camette-Guerin,BCG)膀胱内灌注以来,其良好的抗肿瘤复发及防止肿瘤进展的作用为广大泌尿外科医师所肯定,但BCG抗膀胱肿瘤作用的确切机理目前仍不明确。近年来的研究发现纤维连接蛋白(Fibronectin,FN)在BCG抗膀胱肿瘤过程中起着十分重要的作用。提高FN在膀胱壁上的表达便可提高BCG与膀胱壁的粘附结合,从而增强BCG的抗瘤作用。初步的研究也表明全身凝血途径的改变可影响膀胱壁局部FN的表达水平,从而影响由其介导的BCG与膀胱壁的结合程度,继而影响BCG的抗瘤效应。但至今国内外未见进一步的研究报道。 研究目的:通过随机对照的动物实验来阐述局部应用纤维蛋白溶解抑制药物及制造不同的损伤模型(如切割伤、电灼伤和冷冻伤等)来提高膀胱壁局部FN的表达水平,从而增强BCG与膀胱壁的结合能力,为提高 浙江大学硕士学位论文 BCG抗肿瘤作用的可行性及进一步的临床研究奠定基础。 材料与方法: 1.BCG的培养与标记:将600mgBCG(为冻干粉剂)用sml生理盐 水溶解后加入200mlBCG培养基中,在37aC、5%CO。培养箱中生 长 24 /J’时,再加入 800p Ci[旬-胸腺啼陡核昔继续培养 72小时。 将标记后的BCG经离心、洗涤并用生理盐水稀释成30ml以备用。 2、动物分组与损伤模型的建立:取家兔30只,雌性14只,雄性16 只,编号后随机分入A、B、C、D、E共5组…组为空白对照组, B。C、D、E为实验组),每组6只。每只家兔均于膀眯顶部作长 1.scm切口后,分别在膀恍内行电灼、冷冻、切割等损伤,其中膀 眯左侧壁行电灼,右侧壁行冷冻,范围均为 Icm’,膀肌后壁行切 割伤,用刀片作长 Icm深至粘膜下的切割伤。 3、干扰药物与BCG的灌注:A组(空白对照组):膀眺内单纯sml 磷酸盐缓冲液pBS液)灌注,时间2.5小时;B组JBS+BCG 灌注组):先用 sml PBS液膀肌灌注 30分钟后移去,取 lml’H-BCG )Jl*M生理盐水膀肌内灌注2小时;C组(氨基己酸k邢H*- amlnocaPro沁 add,EACA)+BCG 灌注组):先用 EAcrt (500mg从g)膀眺灌注,30分针后移去 EACA,将 lml’H-BCG力 4M 生理盐水膀肌内灌注2 小时;D 组(氨甲苯酸 (amlnomethylbenzoic acid,PAMBA)+BCG灌注组):先用 PAMBA (25mg/kg)膀脱灌注,30分钟后移去 PAMBA,将 lml’H-BCG力 2 浙江大学硕士学位论文 4ml生理盐水膀脱内灌注 2小时;E组(肝素+BCG灌注组):先用 肝素1250u从g用生理盐水稀释成sml膀耽灌注,刀分钟后移去肝 素液,将 lml‘H、BCG加 4ml生理盐水膀眺内灌注二小时。 4、标本制作与检测:各组经上述灌注后分别在膀耽左侧壁、右侧壁、 后壁损伤处及膀肤前壁未损伤处各取直径 Icm之膀眺壁为标本,PB S 液充分洗涤后用 ZN NaOH溶液消化,取h 消化液加 7ml闪烁液 置入闪烁瓶中,充分混合后用液体闪烁计数器测定每个标本每分钟 的闪烁次数(单位:CPM)。 5、数据统汁与分析:将各标本的液闪测定值汇总后,用SPSS统计软 件包进行分析统计。各种损伤方式之间及不同膀跳灌注方法之间的 比较用非参数统计秩和检验。 结果: l。BCG在膀陇壁损伤处的结合量明显高于末损伤处:实验组中切割 伤、电灼伤、冷冻伤处膀脱壁标本BCG结合量平均值分别为 18965.55士10797.37cpm、19320.61士10322.32cpm。18590.22士 11357.S0cpm,而未损伤处膀眺壁 BCG结合量平均仅为 3994.44 士 1961.93Cplfl,前三者明显高于后者(X‘值分别等于 4 576、 4.662、4.403,尸值均小于0.001);空白组内损伤处膀眺壁标本 液闪 值平均为 4082士22.43cpm,未损伤处为 41.47士27.39cpm, 两者相比无明显差异(H 0.28幻。 2、局部应用(膀肌内灌注)纤维蛋白溶解抑制剂或促进剂后可影 3 浙江大学硕士学位论文 响BCG与损伤处膀眺壁的结合力:实验中空白对照组以组)