论文部分内容阅读
目的：通过长期高脂饮食喂养诱导糖尿病前期模型,观察血管紧张素转换酶2(ACE2)基因缺失对糖尿病前期小鼠胰岛p细胞及胰岛内皮细胞的影响。方法：ACE2基因敲除小鼠及野生型C57小鼠均分为普通饮食(WT, KO)组和高脂饮食(WH,KH)组,喂养16周后,取四组小鼠胰腺行免疫荧光观察小鼠胰岛内胰岛内皮细胞标志物CD31、Insulin的表达变化。免疫组化染色法检测胰岛内VEGF、凋亡蛋白Caspase-3及氧化应激标志物iNOS的表达变化。分离纯化小鼠胰岛,RT-PCR法检测胰岛内炎症因子TNF-α及IL-1β mRNA的相对表达量。体外培养分离纯化的KH组小鼠的胰岛细胞团,给予Ang(1-7)干预重建RAS平衡,观察胰岛细胞分泌功能的改变。结果：在正常饮食条件下,与野生型小鼠(WT组)相比,ACE2基因敲除(KO组)小鼠胰岛内胰岛素相对含量(IRC)和胰岛素阳性细胞核密度(ICD)无明显的变化。与WT组相比,给予16周高脂饮食后, WH组小鼠胰岛内胰岛素相对含量和胰岛素阳性细胞核密度明显减少(P<0.05),同时伴随胰岛局部Caspase-3、iNOS表达增加(P<0.05),胰岛内TNF-α及IL-1β mRNA表达增加(P<0.05),提示高脂饮食诱导的糖尿病前期小鼠胰岛功能受损,胰岛局部炎症反应和氧化应激反应增强。与WH组相比,KH组小鼠胰岛内胰岛素表达进一步减少(P<0.05),胰岛局部Caspase-3、iNOS及TNF-α和IL-1β mRNA表达增加(P<0.05),提示ACE2基因缺失加重了糖尿病前期小鼠胰岛内炎症和氧化应激反应,胰岛功能一进步受损。分离KH组小鼠的胰岛,体外给予Ang(1-7)干预后,其GSIS功能改善(P<0.05)。在正常饮食条件下,野生型小鼠(WT组)和ACE2基因敲除小鼠(KO组)胰岛内CD31阳性细胞表达无明显改变。高脂饮食喂养16周后,WH组CD31阳性细胞明显增多(P<0.05), VEGF表达增加(P<0.05),提示糖尿病前期小鼠胰岛内皮细胞代偿性增多。在高脂饮食条件下,与WH组相比,KH组小鼠胰岛内CD31阳性表达显著减少(P<0.05),VEGF表达减少(P<0.05),提示ACE2基因敲除导致糖尿病前胰岛内皮细胞减少,胰岛微循环失代偿。结论：ACE2基因缺失加重糖尿病前期小鼠胰岛局部的应激反应,胰岛内皮细胞减少,胰岛功能损害。目的：探讨Ang(1-7)干预上调ACF2-Ang(1-7)-Mas轴对生理及高脂培养条件培养的胰岛内皮细胞功能的影响及保护作用。方法：体外培养胰岛内皮细胞系MS-1细胞,给予Ang(1-7)干预后硝酸还原酶法检测NO浓度的变化,Western blot检测Akt-eNOS信号通路活性的改变。棕榈酸及Ang(1-7)干预后检测MS-1细胞Akt-eNOS-NO信号通路活性的变化及细胞内ROS的水平及凋亡改变。结果：在生理条件下,与对照组相比,Ang(1-7)时间依赖性的增加MS-1细胞内Akt-eNOS-NO信号通路活性,表现为AKT、eNOS磷酸化水平增加(P<0.05),细胞生成NO增多(P<O.05),同时给予wortmannin或L-NAME干预后抑制了NO的生成(P<0.05)。Ang(1-7)在MS-1细胞中活化Akt-eNOS-NO通路的效应被A779阻断(P<0.05),提示上调ACE2-Ang(1-7)-Mas轴后,MS-1细胞功能改善。棕榈酸培养24h后,MS-1细胞内ACE2-Ang(1-7)-Mas轴下调,表现为ACE2及Mas受体mRNA及蛋白表达均降低(P<0.05),而ACE-AngⅡ—AT1轴活性增强,ACE及ATl受体表达增加(P<0.05)。与对照组相比,高脂组MS-1细胞内Akt.eNOS磷酸化水平降低(P<0.05),NO生成减少(P<0.05),ROS产生增多(P<0.05),细胞凋亡增加(P<0.05)。与高脂组相比,高脂同时给予Ang(1-7)干预后,细胞内ROS产生减少(P<0.05), Akt. eNOS磷酸化水平增加,NO生成增多,MS-1细胞凋亡明显下降(P<0.05)。而同时加入PI3K或eNOS特异性阻断剂wortmannin或L-NAME后,Ang(1-7)抗脂性凋亡的作用被阻断(P<0.05)。结论：Ang(1-7)上调MS-1细胞内Akt-eNOS-NO信号通路活性,改善MS-1细胞功能。高脂条件下,Ang(1-7)通过上调Akt-eNOS-NO通路,拮抗ACE-AngⅡ-AT1轴活性,减少细胞内氧化应激水平,改善MS-1细胞功能,减少脂性凋亡。目的：体外以Ang(1-7)及Mas干预的不同状态的胰岛内皮细胞与高脂干预的β细胞共培养,研究ACE2-Ang(1-7)-Mas通路介导的胰岛内皮功能对p细胞功能的调节效应。方法：体外建立共培养模型,棕榈酸孵育48h的MIN6细胞与Ang(1-7)及Mas干预的MS-1细胞共培养,分组为：对照组(MIN6组)；棕榈酸干预组(MIN6+PA组)；共培养(Co-culture组)；与Ang(1-7)孵育过的MS-1细胞共培养组(Co-culture+A组)；与Ang(1-7)及A779孵育过的MS-1细胞共培养组(Co-culture+A+7组)。检测MIN6细胞的分泌功能,RT-PCR检测胰岛素mRNA的表达,DCFH检测细胞内ROS的产生,流式检测MIN6细胞凋亡率,Western blot检测MIN6细胞内P65蛋白的表达及JNK和P38通路的改变。结果：与MIN6组相比,MIN6+PA组MIN6细胞的基础胰岛素分泌升高(P<0.05),而GSIS显著降低(P<0.05), Co-culture组GSIS有增加,但差异未达到统计学意义。与MIN6+PA组相比,Co-culture+A组基础胰岛素分泌无显著变化,但GSIS明显改善(P<0.05),同时检测到MIN6细胞内胰岛素mRNA表达增加。高脂培养后,MIN6细胞内AKT磷酸化水平显著降低(P<0.05)。与MIN6+PA组相比,Co-culture组AKT磷酸化水平增加,但差异无统计学意义,Co-culture+A组AKT磷酸化水平显著增加(P<0.05),提示Ang(1-7)可能通过MS-1细胞保护MIN6细胞内胰岛素信号通路免受高脂损害,改善其分泌功能。棕榈酸干预后MIN6细胞的凋亡明显增加(P<0.05),同时检测到细胞内ROS产生显著增加(P<0.05),P65蛋白表达增加(P<0.05), JNK, P38磷酸化水平上升(P<0.05)。与MIN6+PA组相比,Co-culture组MIN6细胞凋亡减少,ROS浓度及P65、 JNK. P38的表达降低,而Co-culture+A组凋亡率明显降低(P<0.05), MIN6细胞内ROS浓度及P65、JNK. P38的表达降低较Co-culture组进一步降低,提示Ang(1-7)通过改善MS-1细胞功能,减轻高脂诱导的应激反应,减少MIN6细胞脂性凋亡。结论：Ang(1-7)通过改善胰岛内皮细胞,减轻胰岛p细胞的高脂损害。