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真核生物和古菌中泛素(UB，Ubiquitin)和类泛素(UBL，Ubiquitin-like protein)在与底物蛋白的缀合途径和细胞代谢活动中扮演着重要的角色，其作用包括参与蛋白酶水解，泛素化(ubiquitylation)中的硫转移代谢和氧化应激反应，以及染色质的重塑和蛋白运输等。而菌体本身为适应高盐浓度的生长环境，进化出适应细胞内外高渗透压平衡的生理机制，进而研究人员对其泛素-蛋白酶体通路是怎样在高盐浓度的环境中保持正常生理活性产生了浓厚的研究兴趣，从而可为真核生物（植物）在抗盐抗旱研究提供基础理论依据。本研究以嗜盐古菌（Haloferax volcanii）为研究对象，根据嗜盐古菌类泛素蛋白SAMPs(small archaea modifier protein)所具有的β-grasp3D折叠结构、C端双甘氨肽(GlyGly)和进化过程的类泛素生化功能，应用基因组学和蛋白组学技术，研究了嗜盐古菌Archaeal类泛素蛋白SAMP1的激活、硫代羧化和底物缀合反应的功能，取得了以下研究结果: 1.嗜盐古菌（Haloferax volcanii）类泛素蛋白SAMP1的缀合底物蛋白类型和缀合位点。 应用基因克隆方法对古菌类泛素samp1基因进行重组，构建带有N端蛋白标签的SAMP1/SAMP1 S85K/R表达质粒与整合质粒，在二甲基亚砜诱导作用下完成细胞内质粒/基因组的泛素化表达与富集。利用亲和色谱对SAMP1/SAMP1突变体蛋白分离纯化，得到SAMP1-缀合底物聚合体，用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Westernblot)确定蛋白组分，经胰蛋白酶酶切聚合体肽段赖氨酸残基上的GlyGly标签，采用高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法对酶切产物及其修饰位点进行分析。 (1)鉴定出与SAMP1缀合的底物蛋白有钼喋呤合成酶（MoaE，Molybdenumcofactor biosynthesis protein）、SAMPs激活酶(UbaA,Molybdopterin biosynthesisprotein)、蛋氨酸亚砜还原酶A/B(MsrA/MsrB，methionine sulfoxide reductasehomologs)、SAMP3和Fe-S簇组装蛋白SufB(FeS assembly protein)6种，且底物蛋白被SAMP1杂链多重修饰。 (2)基因组表达的SAMP1在无氧呼吸作用中起到硫载体和UBL修饰蛋白的作用，并且其缀合作用被DMSO激活。SAMP1化可以调控嗜盐古菌从有氧呼吸过渡至无氧呼吸，这是嗜盐古菌能够在盐湖生存的重要原因之一。 2.嗜盐古菌（Haloferax volcanii）的类泛素活化酶UbaA在细胞内的催化特性。 应用基因组学方法对类泛素活化酶UbaA进行基因重组和定点突变，构建UbaAK87R，D131N和C188A突变菌株，通过添加蛋白标签纯化得到UbaA二聚体。利用LC-MS/MS和Phyre2工具（蛋白同源体/AnalogY识别引擎）构建类泛素活化酶UbaA的3D模型，分析与三磷酸腺苷(ATP)（包括腺苷酸-嘌呤核苷磷酸化酶，AMP-PNP）的结合位点。 (1)当UbaA与SAMPs在1∶2的摩尔比条件下，核苷酸能够刺激UbaA与SAMPs的非共价修饰（UbaA二聚体和SAMP单体），此修饰通过结合敏感性N-乙基马来酰亚胺(NEM)残基，使UbaA与SAMPs在ATP水解作用下形成单一的硫醇键，从而活化SAMPs蛋白，对SAMPs C端双甘氨残基发生的SAMP化起到关键的作用。 (2)通过UbaA的3D模型分析，得到UbaAP-loop相关基序的位置、保守的半胱氨酸残基(Cys188)以及ATP和Zn2+的协同结合位点，得出UbaA的D131具有协调Mg2+与ATP的α(β)磷酸盐的功能。 (3)利用亲和色谱法和SDS-PAGE方法对SAMPs与UbaA进行胞内缀合分析，得出SAMP1与UbaA具有与激活酶UbaA残基和与UbaA的ATP结合囊附近的保守残基结合2种功能。同时发现与UBL活化酶UbaA相关的缀合蛋白为类硫氰酸酶-UbaC和MPT合成酶的催化亚单位MoaE。 (4)通过差示扫描荧光法分析UbaA的核苷酸配基和UbaA-StrepⅡ熔解曲线，结果发现在以核苷酸作为配基的条件下，当ATP和非水解AMP-PNP与UbaA反应时，所有反应的TM值明显升高，ADP对TM值的升高有一定的影响，而AMP，CTP，GTP，UTP和TTP对TM值没有效应。 3.对嗜盐古菌（Haloferax volcanii）类泛素蛋白SAMP1和激活酶E1-like UbaA的分子功能的探究，发现SAMP1具有转译后蛋白缀合(posttranslational protein-conjugation)与硫转移（sulfur mobilization）2种细胞功能，其中包括SAMP1的多种修饰底物蛋白和蛋白缀合位点;从SAMP1与UbaA蛋白的结构因素和酶组分，验证了SAMP1的活化机制和下游调控的硫转移通路和蛋白缀合机制。这一研究对SAMPs蛋白的功能、UB/UBL蛋白进化起源、真核生物的UB解析和利用具有重要的价值和意义。