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背景和目的近年来,上皮间充质转化(EMT)在慢性气道疾病如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)中的作用的研究日益深入,发现其作为气道重塑的重要病理生理环节,促进了哮喘及COPD的进展甚至恶变。目前尚未有明确的药物及治疗方法可以对其进行有效调控,因此研究如何延缓及阻碍EMT的进展具有重要意义。EMT发生机制较为复杂且影响因素众多,其中转化生长因子β1(TGF-β1)及其下游通路的激活发挥了不可忽视的作用。以COPD为例,TGF-β1在COPD患者的血清及组织样本中的水平显著升高,推动了其慢性炎症反应及气道重塑的进展。有研究表明高迁移率组蛋白1(HMGB1)一定程度上参与了 TGF-β1诱导产生的EMT的过程,而作为HMGB1的天然抑制剂,甘草酸可以通过与HMGB1结合降低其蛋白活性,抑制由HMGB1水平升高引起的炎症反应等。本课题旨在研究气道上皮EMT过程中TGF-β1/Smad2/3通路与HMGB1表达的相互影响,探讨甘草酸对TGF-β1诱导产生的EMT的调控及相关作用机制。方法用外源性TGF-β1诱导A549和BEAS-2B细胞产生EMT的改变。分别进行RNA干扰和慢病毒感染实验,并通过实时荧光定量PCR实验检测转染效率,利用western blot实验检测EMT相关标记物E-钙粘蛋白及波形蛋白的改变,研究HMGB1在TGF-β1诱导的EMT过程中的作用。用Elisa试剂盒检测细胞培养2上清中HMGB1的浓度改变,探究HMGB1的从核内到胞外易位过程。CCK-8法用于检测经不同浓度的甘草酸处理后A549和BEAS-2B细胞的存活率,选择合适的甘草酸处理浓度。将上皮细胞各自分为:正常对照组、阴性对照组、HMGB1过表达组、甘草酸+HMGB1过表达组,利用western blot实验探究甘草酸处理对HMGB1水平升高导致的EMT的影响。然后将上皮细胞各自分为:正常对照组、TGF-β1处理组、甘草酸+TGF-β1处理组,通过western blot和免疫荧光染色法评价甘草酸对TGF-β1诱导的EMT标记物的改变,利用细胞迁移实验(transwell)观察甘草酸对TGF-β1诱导下细胞迁移能力的变化。最后通过western blot实验检测上述各分组中TGF-β1/Smad2/3信号通路蛋白表达量的变化。结果1.敲低HMGB1可逆转由TGF-β1诱导A549及BEAS-2B细胞产生的EMT改变。外源性TGF-β1处理24h后,可检测到HMGB1蛋白表达增高,释放增多,正常细胞发生相应的EMT改变,即E-钙粘蛋白表达降低,而波形蛋白表达升高,且在显微镜下可观察到上皮细胞的形态趋向间质化。而在HMGB1敲低+TGF-β1处理组的细胞中,以上所述EMT改变均得到逆转。2.甘草酸处理可抑制由HMGB1慢病毒过表达引起的肺上皮细胞的EMT改变。肺上皮细胞中的HMGB1过表达后,可检测到E-钙粘蛋白水平降低,波形蛋白水平升高。分别选用50μM,100μM,200μM的甘草酸处理A549细胞24h,用25μM,50μM,100μM的甘草酸处理BEAS-2B细胞24h。在HMGB1过表达+甘草酸处理组的细胞中,E-钙粘蛋白水平明显升高,波形蛋白水平相应降低。3.甘草酸可通过抑制HMGB1阻碍由TGF-β1诱导的肺上皮细胞EMT改变。在用不同浓度甘草酸预处理细胞2h后,加入外源TGF-β1继续处理细胞24h。Elisa测得TGF-β1处理使细胞培养上清中HMGB1浓度明显升高,而甘草酸预处理降低了上清中HMGB1的水平。Western blot及免疫荧光染色均测得,甘草酸+TGF-β1处理组的细胞与单纯TGF-β1处理组的细胞相比,E-钙粘蛋白水平较高,而波形蛋白水平较低。4.甘草酸可抑制TGF-β1引起的上皮细胞迁移。TGF-β1处理组中,发生迁移的细胞数目较正常组明显增多,而甘草酸+TGF-β1处理组的细胞迁移数目明显减少,且与甘草酸浓度大小表现为负相关。5.甘草酸可通过抑制HMGB1部分阻断TGF-β1/Smad2/3信号通路的激活。在HMGB1过表达细胞中,TGF-β1、磷酸化Smad2、磷酸化Smad3蛋白水平均高于正常细胞,表明了 TGF-β1/Smad2/3信号通路的激活。HMGB1过表达+甘草酸处理的细胞中,上述通路蛋白的表达量均得以降低。外源性TGF-β1处理后,下游Sma2/3信号通路激活,而甘草酸处理可使相应的通路蛋白水平降低。结论HMGB1促进了 TGF-β1诱导产生的人肺上皮细胞EMT的过程。甘草酸通过抑制HMGB1可部分阻断TGF-β1/Smad2/3信号通路的激活,降低了肺上皮细胞的迁移能力,抑制甚至一定程度上逆转了 TGF-β1诱导的EMT进程。