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山羊生产中,胎盘早期的正常生长和发育是影响母畜繁殖性能及羔羊品质的关键因素。滋养层细胞是早期胎盘组织功能体现的主要成分之一,并且在胚胎附植、入侵子宫等过程中起着重要的调节作用。TET1(ten-eleven translocation 1)作为去甲基化主导作用的双加氧酶成员,在哺乳动物早期胎盘发育、胚胎着床、胎儿生长、基因组印记以及相关信号通路调控中具有普遍作用。同时,大量研究证实由Wnt分子启动的Wnt信号通路,广泛参与细胞命运决定、胎儿发育和胎盘形成等生命过程。所以,在哺乳动物胎盘发育过程中,两者的生理功能、调控位置和作用阶段都具有一定的相似性和同步性。但是,在山羊胎盘滋养层细胞(goat placental trophoblast cells,GTCs)的分化和发育过程中,TET1是否通过Wnt信号通路相关分子发挥调控作用,目前还没有相关报道。通过建立原代GTCs体外培养体系,过表达及shRNA干扰调节GTCs中TET1的表达,研究GTCs的活性和迁移能力,比较Wnt通路相关基因mRNA相对表达量,从转录表达途径上揭示GTCs中TET1对Wnt信号通路相关基因的调控作用,从而研究TET1如何通过Wnt信号通路相关分子调控山羊胎盘滋养层细胞的发育,探索影响山羊胎盘发育及胎儿初生重、成活率等繁殖力性状的内在因素,丰富发育生物学和表观遗传学知识,为山羊的分子育种及相关应用基础研究提供新线索。本研究以45-60 d山羊胎盘为研究对象,采集胎盘绒毛膜,使用组织块与细胞共培养法分离培养原代GTCs。Dox(doxycycline)诱导及piLenti-shTET1-GFP质粒转染处理GTCs,然后用RT-qPCR(real-time quantitative polymerase chain reaction)和免疫细胞化学(immunocytochemistry,ICC)分别检测GTCs中TET1基因mRNA水平和蛋白表达量以及细胞整体甲基化水平及羟甲基化水平;RT-qPCR检测比较Wnt信号通路相关基因相对表达量;MTS及划痕检测GTCs活性及迁移能力。主要研究结果如下:1.本研究利用组织块与细胞共培养法分离培养、差速消化法纯化得到了形态均一、纯度较高的山羊胎盘原代滋养层细胞。原代GTCs贴壁后前期呈梭形,后期呈不规则多边形。纯化的GTCs特异性表达细胞角蛋白7(cytokeratin,CK-7)。2.Dox可诱导GTCs中TET1基因的表达。与对照组相比,Dox浓度为20 ng/μL时TET1基因mRNA相对表达量由2.07上调至4.64,差异极显著(P<0.01);TET1蛋白表达水平也明显升高。MTS检测细胞活性结果发现Dox处理2 d后细胞活性由0.67降至0.52,下降了22.13%,差异显著(P<0.05)。划痕试验显示,GTCs中以最适浓度(20 ng/μL)Dox诱导TET1过表达后细胞平均迁移能力由490.75μm下降至177.17μm,下降了63.90%。3.Dox诱导TET1高表达后,细胞整体5mC(5-methylcytosine)水平显著下降,整体5hmC(5-hydroxymethylcytosine)水平显著升高;Wnt通路上游抑制剂DKK家族(DKK1除外)及SFRP家族基因表达整体呈上升趋势,其中SFRP2、SFRP4、SFRP5、DKK3和DKK4基因mRNA相对表达量分别由1.19、2.68、283.03、562.53和1.55上调至10.39、3.61、621.44、1023.42和9.69,差异显著(P<0.05);此外,MYC、GSK-3β、PPARG、CCND2、CTNNB1表达呈上升趋势,其中MYC、GSK-3β和PPARG基因mRNA相对表达量分别由1.10、1.05和1.09上调至6.42、4.22和24.80,差异极显著(P<0.01)。4.构建并筛选了piLenti-shTET1-GFP重组表达质粒。针对山羊TET1基因序列,构建了4个shRNA干扰载体,并成功筛选出1个干扰效率最高的TET1 shRNA质粒。与piLenti-GFP对照组相比,piLenti-shTET1-GFP质粒转染GTCs后细胞TET1基因mRNA相对表达量4.82降至2.46,差异极显著(P<0.01);TET1蛋白表达水平明显下降。GTCs中用piLenti-shTET1-GFP质粒转染干扰TET1表达后细胞平均迁移能力由127.01μm升至229.41μm,上升了80.62%。5.干扰TET1表达后,细胞整体5mC水平显著升高,整体5hmC水平显著下降。Wnt通路上游抑制剂DKK家族(DKK1除外)及SFRP家族基因表达整体呈下降趋势;同时,GSK-3β、PPARG、CCND2和CTNNB1表达呈下降趋势,其中SFRP1基因mRNA相对表达量由249.70降至186.41,差异显著(P<0.05)。结论:1.利用组织块与细胞共培养法分离培养、差速消化法纯化得到了形态均一、纯度较高的原代GTCs;Dox处理可诱导GTCs中TET1的表达;成功筛选出干扰效率最高的TET1 shRNA质粒1个。2.Dox诱导TET1高表达后,GTCs迁移能力显著下降;干扰TET1表达后,则相反。3.Dox诱导TET1高表达后,GTCs整体5mC水平显著下降,整体5hmC水平显著升高;干扰TET1表达后,则相反。4.Dox诱导TET1高表达后,Wnt通路上游抑制剂DKK家族(DKK1除外)及SFRP家族基因表达整体呈上升趋势;干扰TET1表达后,则相反。