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容积敏感性氯离子通道全称容积敏感性、外向整流性氯离子通道（volume-sensitive outward rectification chloride channel,VSOR Cl-channel）,也被称为容积调节的阴离子通道（volume-regulated anion channel,VRAC）,大量分布在哺乳动物组织和细胞,参与了调节细胞体积、细胞增殖与分化、免疫反应、细胞膜电位、细胞内PH及凋亡等多种病理、生理过程。而且它还参与了多种心血管系统疾病的发生和发展,如:阻断VSOR Cl-通道可以延长动电位时程、心肌不应期而预防恶性心律失常,可以减轻缺血再灌注导致的心肌细胞损伤,抑制心肌肥厚,还可以减少梗死心肌的范围,恢复心脏基本功能等。因此干预及调节VSOR Cl-通道的功能,能成为保护心肌的靶点。近年来由于对该通道的不断深入研究,VSOR Cl-通道的主要编码蛋白LRRC8A于2014年首次被发现了,为进一步研究VSOR Cl-通道打下了坚定的基础。最新研究表明VSOR Cl-通道不是直接被机械应力刺激激活,而是涉及了离子强度和细胞膜的紧张度的敏感性。该通道的激活不仅涉及到了胞内Ca2+及ATP水平,还涉及到窖蛋白（caveolin,Cav）、细胞膜的脂质构成、肌动蛋白细胞骨架和G蛋白等。而且研究发现,不仅离子通道本身,与之相结合的蛋白结构的异常和（或）功能的改变均可导致一系列的病理变化。其中发挥膜储备作用的caveolin,也是最常见的细胞质膜上的离子通道结合蛋白。研究指出,caveolin可以和阳离子通道K+,Na+,Ca2+等形成复合物,caveolin结构的改变及功能的异常,可以引起上述这些离子通道功能的异常,甚至引起系统疾病、离子通道病等。然而仅有几例关于caveolin与阴离子通道关系的报道,目前尚无caveolin与VSOR Cl-通道编码蛋白关系及其相关机制的研究。因此,本研究拟:（1）探讨VSOR Cl-通道编码蛋白LRRC8A在细胞膜上的具体定位,及其与caveolin的定位关系;（2）进一步说明caveolin对VSOR Cl-通道功能的影响,是否调控了VSOR Cl-通道的开放,及如何发挥调控作用的?研究目的1.探讨Cav-1/3与LRRC8A在心肌细胞膜上的定位及二者定位关系。2.探讨Cav-1/3是否对心肌细胞VSOR Cl-通道的功能产生影响。3.探讨Cav-1/3对VSOR Cl-编码蛋白LRRC8A表达水平的影响。实验方法1.实验分组:等渗刺激,低渗刺激,实验组（低渗刺激+DIDS/低渗刺激+MβCD）,Cav-1/3 siRNA+等渗刺激,Cav-1/3 siRNA+低渗刺激;2.乳鼠心肌细胞的原代培养:常规分离乳鼠心脏、剪碎、消化、离心、重悬、差速贴壁及培养备用;3.免疫荧光染色检测心肌细胞膜上LRRC8A、Cav-1及Cav-3的定位;4.蔗糖密度超速离心技术:获取富含cveolin的片段;5.Western blot蛋白检测技术:检测目的蛋白LRRC8A,Cav-1,Cav-3的表达水平;6.免疫共沉淀技术:检测目的蛋白LRRC8A与Cav-1,及LRRC8A与Cav-3有无共沉淀;7.膜片钳全细胞记录技术:检测等渗、低渗、加入VSOR Cl-通道非特异性阻滞剂DIDS及caveolin破坏剂MβCD处理后,心肌细胞上ICl,vol电流的变化。8.siRNA基因沉默技术:含Cav-1或Cav-3基因的siRNA片段转染H9C2心肌细胞系48-72h,重新贴壁,膜片钳检测ICl,vol电流的变化;及Western blot检测LRRC8A膜蛋白随着Cav-1基因沉默的变化。9.流式细胞检测技术:对H9C2心肌细胞系在等渗、低渗、低渗+MβCD等不同条件下检测心肌细胞容积的变化,并绘制曲线图。10.MQAE氯离子荧光检测技术:心肌细胞在等渗、低渗、低渗+DIDS、低渗+MβCD不同条件下,观察细胞荧光强度的变化及全波长酶标仪检测不同组荧光值的变化。11.Cav-1基因过表达、转染技术:构建p CMV-myc-Cav-1载体、质粒合成、转染心肌细胞系（H9C2）,Western blot检测LRRC8A膜蛋白随着Cav-1蛋白过表达的变化。实验结果1.免疫荧光染色技术显示:荧光倒置显微镜下观察,Cav-1/3（红色）,LRRC8A（绿色）,黄色即提示二者分布一致,结果显示Cav-1/3与LRRC8A存在共定位关系。2.选取原代培养的心肌细胞,利用蔗糖密度超速离心法,按照超声离心物分层的结果,分别获取1-12份不同比重的细胞沉淀物,离心、提取蛋白后,蛋白免疫印迹法显示:Cav-1、Cav-3与LRRC8A均分布在相同比重的膜窖富集区条带,并形成免疫共沉淀复合物,提示二者Cav-1/3与LRRC8A存在直接接触的基础。3.低于正常渗透压的外液（220 Osmol/kg H2O）灌流心肌细胞,VSOR Cl-通道被激活,ICl,Vol电流逐渐增大并稳定,电压达到+80m V及以上时,具有时间、电压依赖性失活,+100m V时计算ICl,Vol的密度为98.45±1.76 p A/p F（n=5）,在+40m V,+60m V,+80m V及+100m V时均可被DIDS呈电压依赖性阻断,I/V曲线提示该电流呈外向整流性,+100m V对ICl,Vol电流的抑制率为90.22±11.50%（P<0.01 vs HYPO,n=5）。4.同样低于正常渗透压的外液（220 Osmol/kg H2O）灌洗原代培养的心肌细胞,记录到阳性ICl,Vol电流后,再加入含有10mmol/L MβCD的低渗外液后,该电流在+40m V,+60m V,+80m V及+100m V时也可被MβCD呈电压依赖性阻断,+100m V时的电流密度为36.57±10.46 p A/p F,抑制率为91.86±12.70%（P<0.01 vs HYPO,n=3）。5.含2.5mmol/L MβCD的培养液预孵育细胞半小时,实验前给予含有相同浓度MβCD的低渗外液,记录到的ICl,Vol电流明显减少,在+40m V,+60m V,+80m V及+100m V时,该电流呈现出明显的电压依赖性阻断,+100m V时的电流密度为25.95±4.75 p A/p F,MβCD对ICl,Vol的抑制率为89.19±8.35%（P<0.01 vs HYPO,n=4）。6.应用Cav-1的siRNA及Cav-3的siRNA处理H9C2心肌细胞系72h后,置低渗灌流液中,在siRNA沉默Cav-1组,未能记录到阳性电流,+100m V时的电流密度为28.53±7.04p A/p F,抑制率达到78.27±7.93%（n=4,P<0.01 vs HYPO）,而在siRNA沉默Cav-3组,可记录到阳性ICl,Vol电流,+100m V时的电流密度为77.85±3.04p A/p F,较低渗组无明显差异（P>0.05 vs HYPO,n=4）。7.在等渗、低渗、低渗+MβCD等不同条件下处理H9C2细胞1h后,流式细胞仪检测细胞体积,结果显示:与低渗组比较,低渗+MβCD组细胞体积未见明显增大,提示caveolin可能通过干预VSPR Cl-通道的功能,而发挥调节细胞体积的作用。8.应用MQAE检测细胞内Cl-浓度,结果显示:低渗组荧光强度最强,低渗+DIDS组及低渗+MβCD组荧光强度均较低渗组明显减弱（P<0.01,n=6）,而低渗+DIDS组与低渗+MβCD组比较,胞内Cl-荧光强度相当,无统计差异（P>0.05,n=6）。9.应用Cav-1的siRNA处理后,LRRC8A膜蛋白相应减少,统计存在显著性差异（P<0.05,n=6）;过表达Cav-1后,LRRC8A膜蛋白表达无明显增加,统计学无显著差异（P>0.05,n=6）。结论1.Cav-1/3与LRRC8A位于心肌细胞的膜窖内,呈现共定位关系。2.破坏及干扰掉caveolin,可以显著减弱低渗刺激下心肌细胞的容积敏感性氯电流、阻止了细胞体积的增大。3.Cav-1对LRRC8A具有调节作用,Cav-1的表达水平调节着LRRC8A蛋白的功能。