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纤维素酶是有外切葡聚糖酶(exoglucanase)、内切葡聚糖酶(endo-glucanase)和p葡萄糖苷酶(β-1,4-glucosiase)三种酶组成的一种复合酶,它能够降解纤维素,使其生成纤维二糖、葡萄糖。纤维素水解酶系一个重要的组分是p-葡萄糖苷酶,p-葡萄糖苷酶活力的大小严重影响纤维素酶降解纤维素的水平。随着纤维素酶在在实际生活中的广泛应用,比如纺织、医药、饲料和食品等行业,纤维素酶酶制剂逐渐受到重视,显示出巨大的经济价值。本文利用基因工程技术,实现了枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)来源的内切葡聚糖酶基因和米曲霉(Aspergillus oryzae)来源的p-葡萄糖苷酶基因分别在大肠杆菌中的高效表达,同时将内切葡聚糖酶基因和p-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中得以共同表达,对其表达产物进行酶学性质研究,进而对共表达工程菌发酵产酶条件进行研究。1使用生物信息学方法,对枯草草芽胞杆菌内切葡聚糖酶基因(GEN BANK: DQ782954)和来源于米曲霉的p-葡聚糖酶基因的蛋白质序列的蛋白质结构分析以及对其信号肽的预测,设计出去除信号肽的引物序列,并在其引物的5’端了引入了相应的酶切位点。通过PCR扩增获得了内切葡聚糖酶基因和β-葡萄糖苷酶基因片段,大小分别为1500bp和2800bp左右,并且成功构建了pET32a-EG和pET30b-BGL载体,分别转化到大肠杆菌表达菌株(Escherichia coli)BL21,通过带有Amp(或Kan)抗性LB平板筛选和酶活测定,获得了高效表达的转化子,重组基因工程菌产内切葡聚糖酶和p-葡萄糖苷酶酶活分别为821.5U/mL、219.6U/mL。SDS-PAGE分析表明,两种表达产物分子量约为55kD和90kD,内切葡聚糖酶和p-葡萄糖苷酶最适pH分别为6.0和5.0,最适反应温度为都是60-C。2以内切葡聚糖酶基因片段构建的pET32a-EG重组载体,转化到已整合含有p-葡萄糖苷酶基因的大肠杆菌表达菌株(Escherichia coli)BL21基因组中,通过含有Amp/Kan抗生素LB平板进行双抗筛选和酶活测定,获得了两种酶同步表达的转化子,诱导表达后,筛选出其中酶活最高的菌株命名为pET32a-EG-pET30b-BGL Ⅱ,其酶活为1196.8U/mL,通过对工程菌pET32a-EG-pET30b-BGL Ⅱ产的酶进行酶学性质分析,得出其最适温度和最适pH值分别为60-C和6.0,在温度30-60℃和pH5-7范围内可保持最高活力80%以上。3利用Plackett-Burman进行实验设计,对接种量(A)、培养温度(B)、装液量(C)、诱导时间(D)、初始pH (E)、IPTG诱导浓度(F)6个因素进行评价,进行方差分析。结果表明,影响工程菌pET32a-EG-pET30b-BGL Ⅱ产酶的主要因素有培养温度、初始pH和装液量；在此实验基础上,进一步用Box-Behnken的响应面分析,对这3个因素进行了优化,当温度为35℃,初始pH7.5,装液量为25mL(容积为100mL),pET32a-EG-pET30b-BGL Ⅱ产酶的酶活最高为2080.5U/mL,较优化前的1196.8 U/mL提高了将近一倍。