[研究背景]亚健康状态是指机体虽没有明确的疾病诊断,却呈现出一系列的功能性改变,从而体现在身心情感等方面处于健康与疾病之间的健康低质量状态,常以一多三少(一多指疲劳多；三少即三种减退：活力减退、反应能力减退和适应能力减退)为主要表现。广州(本课题组)、北京等相关单位的亚健康流行病学调查研究表明：亚健康人群发生率为60%～70%,并呈现以下几个方面的特点：(1)具有普遍性；(2)具有不易被个人所意识的隐匿性和潜伏性；(3)具有不为医学所确认的客观性和明确性；(4)具有向多种慢性疾病发展的趋向性和向健康逆转的可逆性。亚健康的临床表现多种多样,而通过本课题组的大规模亚健康流行病学调查研究表明,其中疲劳不仅是亚健康状态的重要临床表现之一,也是导致亚健康发生发展的重要原因,疲劳型亚健康是亚健康的主要类型之一。疲劳型亚健康状态的发生可能与日益加快的生活、工作节奏,不断加重的心理及社会压力,缺乏规律的饮食,长期睡眠不足等因素有关,至于这些相关因素通过何种途径导致疲劳型亚健康状态的发生至今尚不清楚。如果将疲劳型亚健康相关发生因素分类的话,过度疲劳、长期压力、愤怒、忧郁、睡眠障碍等可归纳为躯体或心理应激的范畴。应激是指机体在受到应激原的刺激时所出现的非特异性全身反应,主要表现在通过释放一系列激素和神经递质来提高机体基础代谢水平,使机体处于最佳动员状态,以克服应激原对机体的损害,其中肾上腺皮质兴奋性增强,糖皮质激素分泌增加,在应激发生时起着非常重要的作用。然而如果劣性应激原持续作用于机体,则应激可表现为一个动态的连续过程,并由相应激素的靶效应最终导致内环境紊乱和疾病发生。过度疲劳、长期压力、睡眠障碍等应激正是这样一种持续存在的劣性应激源,长期作用于机体将导致“健康-亚健康-疾病”的动态发展,亚健康是介于健康与疾病之间的一种中间状态,与其上游的健康和下游的疾病之间存在移行变化,这种移行变化是双向的,形成健康-亚健康-疾病的动态变化过程,因此早期干预以促进其向健康恢复及阻止其向疾病发展显得尤为重要。由于亚健康发病机制的不明确使得目前尚缺乏有效的西医治疗手段,维康颗粒针对亚健康发生因素,以调节脏腑阴阳、气血为目的研制而成,据临床观察表明维康颗粒对于患者的疲劳型亚健康状态具有良好的改善作用。为深入研究疲劳型亚健康的发生发展机制,因此需要引进疲劳型亚健康模型以克服人体试验的局限性,然而目前尚没有相关动物模型。故本课题意在通过建立疲劳型亚健康小鼠模型,探讨慢性疲劳应激下疲劳型亚健康发生发展机制以及维康颗粒干预疲劳型亚健康防止其向疾病发展的机制。本课题将分两部分进行：第一部分：疲劳型亚健康小鼠模型的建立第二部分：维康颗粒对疲劳型亚健康小鼠血清皮质酮的影响[目的]第一部分：模拟疲劳型亚健康主要发生因素,建立疲劳型亚健康小鼠模型,根据小鼠精神行为、疲劳测定、病理、生化、血常规等指标和血清皮质酮水平对疲劳型亚健康小鼠模型进行界定和优效性评价。第二部分：观察维康颗粒在血清皮质酮水平对疲劳型亚健康的干预作用,为研究维康颗粒干预疲劳型亚健康的靶向治疗机理奠定前期基础。[方法]第一部分：模型组参照本课题组方法(疲劳型亚健康大鼠模型)并加以改进,将各组小鼠置于水深为0.8cm、大小为29cm×18cm×15cm的塑料盒内,每盒5只,来模拟过度疲劳、拥挤、睡眠不足、恐惧、焦虑等应激因素以造成小鼠亚健康疲劳状态。正常对照组不给予任何刺激,自由饮食。测定负7%体重力竭游泳时间(水温25℃；负重：用橡皮筋将7%自身重量的铅坠系于小鼠尾部；力竭游泳标准：小鼠鼻尖沉入水下10s),以评估小鼠疲劳程度。实验一：确定造模强度SPF级健康雄性KM小鼠40只,完全随机分为：正常对照组、造模6h组、造模8h组、造模10h组,每组10只,持续造模21天,每3天测定一次力竭游泳时间以评估疲劳程度。实验二：确定造模时间SPF级健康雄性KM小鼠150只,完全随机分为：(1)正常对照：0天组、5天组、9天组、12天组、16天组；(2)造模：0天组、5天组、9天组、12天组、16天组；(3)生化血常规检测：正常对照组、造模5天组、造模9天组、造模12天组、造模16天组,每组10只。将造模各组小鼠置于塑料盒内8h／天,每盒5只,分别持续0、5、9、12、16天造模。各组小鼠于造模结束前负7%体重力竭游泳一次以评估疲劳程度。放射免疫法检测血清皮质酮含量。实验三：模型的评价SPF级健康雄性KM小鼠40只,完全随机分为：正常对照组、疲劳型亚健康模型组(造模9天／每天8h)、自然恢复7天组(造模9天后恢复7天)、自然恢复14天组(造模9天后恢复14天),每组10只。各组小鼠于造模结束前负7%体重力竭游泳一次以评估疲劳程度。放射免疫法检测血清皮质酮含量。第二部分：疲劳型亚健康模型组小鼠,造模9天后立即处死取材；模型恢复组,造模9天后生理盐水灌胃7天。维康高、中、低剂量组分别于造模9天后给予高、中、低剂量的维康颗粒水溶液灌胃7天。正常对照组正常饮食。实验四：SPF级健康雄性KM小鼠60只,完全随机分为：正常对照组,疲劳型亚健康模型组、模型恢复组、维康高剂量组、维康中剂量组、维康低剂量组,每组10只。各组小鼠于造模结束前负7%体重力竭游泳一次以评估疲劳程度。放射免疫法检测血清皮质酮含量。[结果]实验一：随着造模时间的延长：(1)造模6h组小鼠力竭游泳时间缓慢减少,第12天出现显著性差异(P<0.01)。(2)造模8h组小鼠力竭游泳时间显著减少,第3天出现显著性差异(P<0.05),6至12天下降明显。(3)造模10h组力竭游泳时间急剧减少,第3天出现显著性差异(P<0.01)。实验二：随着实验天数延长：(1)正常对照组小鼠体重显著增加(P<0.05),模型组无显著性差异(P>0.05)。(2)正常对照组小鼠力竭游泳时间无显著性差异(P>0.05),模型组小鼠力竭游泳时间逐渐减少,5天组出现显著性差异(P<0.01)。(3)正常对照组小鼠血清皮质酮无显著性差异(P>0.05),模型组小鼠血清皮质酮在第9天前无显著性差异(P>0.05),第9天时出现显著性升高(P<0.05)。(4)造模9天时,小鼠血清生化、血常规与正常对照组比较均无显著性差异(P>0.05)。实验三：与正常对照组比较：(1)疲劳型亚健康模型组游泳时间和血清皮质酮有显著差异(P<0.05)。(2)恢复7天组游泳时间有显著性差异(P<0.05),而血清皮质酮无显著性差异(P>0.05)。(3)恢复14天组游泳时间和血清皮质酮均无显著差异(P>0.05)。(4)恢复14天与恢复7天比较,游泳时间显著增加(P<0.05),血清皮质酮显著降低(P<0.05)。实验四：与正常对照组比较：疲劳型亚健康模型组和模型恢复组力竭游泳时间显著降低(P<0.05),血清皮质酮显著增加(P<0.05),维康高剂量组和维康中剂量组游泳时间和血皮质酮均无显著性差异(P>0.05),维康低剂量组游泳时间显著性降低(P<0.05),血清皮质酮显著增加(P<0.05)。[结论]1.本研究通过模拟疲劳型亚健康相关发生因素,强迫小鼠每天在水盒中站立8h,连续造模9d,成功制备出疲劳型亚健康小鼠模型。2.去除疲劳型亚健康发病因素,亚健康状态能自行康复,但需时间较长,而应用维康颗粒干预治疗,可明显改善小鼠疲劳状态,显著提高疲劳型亚健康小鼠力竭游泳时间,阻断向疾病的发展,缩短亚健康康复时间。3.过度疲劳、睡眠障碍、心理应激等慢性应激因素持续作用引起的肾上腺皮质功能病理性亢进,糖皮质激素病理性升高可能参与了疲劳型亚健康的发生发展。4.维康颗粒能够下调疲劳型亚健康小鼠血清皮质酮水平,可能是其干预疲劳型亚健康的药理作用之一