作为一种天然的宿主防御多肽(host defense peptides,HDP),蜂毒肽具有多种多样的免疫调节效应,但是目前尚缺乏在肿瘤免疫治疗方面的应用研究,其主要原因是静脉给药时具有极强的溶血副作用,即使是皮下注射,也会因为极低的分子量,易入血并被肾脏快速清除,导致其难以在免疫器官(如淋巴结、肝脏等)中聚集,最终无法在体发挥其免疫调节效应。本课题组前期已经成功地将melittin装载到仿HDL多肽脂质纳米载体上,得到了生物相容性好的蜂毒肽脂质纳米颗粒(α-melittin-NP),有效地解决了其在体内运输中存在的溶血副作用,显著延长了血液半衰期,为活体内研究melittin对免疫系统的调节效应并应用于肿瘤免疫治疗奠定了基础。在本研究中,我们采用了两种给药方式,在体研究了其对免疫系统的刺激效应。我们发现皮下注射给药时,melittin在仿HDL载体协助下,能够顺利引流至淋巴结,并被淋巴结内专职性抗原提呈细胞(APCs)所摄取,进而激活APCs重塑淋巴微环境;当静脉给药时,α-melittin-NP能够快速高效靶向肝脏特有的非专职性APC,即肝血窦内皮细胞(LSEC),并能特异性激活LSEC,促使其分泌与淋巴细胞浸润和激活相关的细胞因子及趋化因子,进而改善肝脏固有的免疫耐受微环境,成功抑制了多种肿瘤的肝转移。主要研究结果如下:(1)α-melittin-NP在仿HDL载体的协助下明显屏蔽了melittin对APCs的细胞毒性。通过分离培养骨髓来源的树突状细胞(BMDC)、骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)及LSEC,然后使用动态成像及MTS的方法检测不同浓度药物孵育后APCs的细胞活力,结果显示,即使在高浓度下(20μM),α-melittin-NP对上述三种APCs均没有明显的细胞毒性,然而,低浓度melittin(5μM)就会导致大约70%的BMDC及90%的BMDM和LSEC细胞死亡。(2)α-melittin-NP能够体外诱导专职性及非专职性APCs活化。流式结果显示,α-melittin-NP(5μM)能够上调BMDC和BMDM的共刺激分子(CD80、CD86)的表达,并促进IL-12p70细胞因子的分泌。与LSEC孵育后,也能上调CD80的表达,同时也能够促进多种与免疫细胞浸润和激活相关的细胞因子及趋化因子的分泌。(3)α-melittin-NP可在体靶向淋巴结,重塑淋巴微环境,诱导显著的原位肿瘤疫苗效应。皮下注射给药时,α-melittin-NP在3 h内即可到达腹股沟及腋下淋巴结,并被淋巴结内驻留的巨噬细胞和DC吞噬,24 h后巨噬细胞和DC高表达CD80和CD86等共刺激分子。同时,肿瘤切片结果显示,α-melittin-NP可诱导tf RFP肿瘤模型抗原释放。通过建立双边肿瘤模型,我们发现单侧瘤内注射α-melittin-NP可以诱导92%的远位肿瘤生长抑制及50%的远位肿瘤完全消退。(4)α-melittin-NP可靶向调控LSEC,改善肝脏耐受免疫微环境,成功抑制多种肿瘤肝转移。活体动态成像结果显示,静脉注射荧光标记的α-melittin-NP后,LSEC在1 min之内迅速被点亮,并能维持长达12 h的高效靶向标记作用。LSEC细胞转录组测序结果表明,α-melittin-NP作用后的LSEC免疫激活相关分子m RNA水平显著升高。结合流式细胞术和液相多因子联检技术,我们发现α-melittin-NPs作用后的LSEC高表达共刺激分子(CD80、CD86、MHC-Ⅱ),肝脏内细胞因子(如IL-1α)以及趋化因子(如CXCL9、CXCL10)水平升高,并且免疫细胞浸润增加及NK细胞活化。肿瘤治疗结果显示,α-melittin-NP能够有效抑制黑色素瘤、乳腺癌及结肠癌的实验性肝转移和乳腺癌的自发性肝转移,并明显延长小鼠生存率。综上所述,本课题充分利用了仿HDL纳米载体的优良特性,研究了α-melittin-NP对专职性及非专职性APCs的免疫调节效应以及其在肿瘤免疫治疗中的应用。在不负载佐剂及特定肿瘤抗原的情况下,皮下注射α-melittin-NPs可靶向激活淋巴结内专职性APCs,诱导全肿瘤细胞抗原特异性的细胞免疫和体液免疫反应,进而引起显著的原位肿瘤疫苗效应。静脉注射α-melittin-NPs时,能够快速并且特异性地靶向肝脏特有的非专职性APC(LSEC),促使其活化,改善肝脏耐受的免疫微环境,成功抑制了多种肿瘤肝转移。因此,本研究为基于APC的肿瘤免疫治疗提供了新的靶向策略和治疗方法。