2型糖尿病（Type2diabetes mellitus, T2DM）是心血管疾病的独立致病因素，绝大多数2型糖尿病患者最终会死于心血管相关并发症，但目前仍无明确有效的方法能够阻止T2DM心血管并发症的发生。近年来，大量的临床和基础研究证明，糖尿病患者补充n-3系多不饱和脂肪酸（n-3Polyunsaturated fatty acids, n-3PUFAs），主要是DHA和EPA，可以有效的降低心血管并发症的发病率和致死率。作为心血管并发症的一级预防策略，美国糖尿病协会和美国心脏协会已推荐糖尿病患者增加n-3PUFAs在饮食中的比例。但n-3PUFAs发挥心血管保护作用的确切机制尚不清楚。n-3PUFAs及其代谢衍生物具有抗炎，抗氧化应激，调节离子通道，参与构成细胞膜结构，增加细胞膜流动性和调节基因表达等多种生物学功能，是人体各组织器官不可缺少的营养必需脂肪酸。2型糖尿病患者补充n-3PUFAs之所以可对其心肌起保护作用，是否是由于糖尿病心肌n-3PUFAs低于正常的水平？是何种原因造成？补充的n-3PUFAs又是通过何种分子机制保护心肌？为了解决上述问题，本研究选择高脂饮食加小剂量STZ方法诱导的2型糖尿病大鼠心肌和长链饱和脂肪酸处理的H9C2心肌细胞作为研究对象，进行以下三部分研究：一、T2DM大鼠心肌脂肪酸构成的改变及n-3PUFAs下降的原因；二、饮食补充DHA对T2DM大鼠心肌DHA含量，心功能和心肌mRNA表达谱的影响；三、DHA保护T2DM心肌的分子机制研究。通过上述三个部分的研究，证实T2DM心肌n-3PUFAs的下降及下降原因；从组织器官水平寻找DHA心脏保护作用的靶点并在细胞水平对DHA作用的分子机制进行验证。为临床应用DHA防治2型糖尿病心血管并发症提供实验依据和理论基础。第一部分2型糖尿病大鼠心肌n-3PUFAs的减少与过氧化物酶体β氧化活性增加的关系目的：研究2型糖尿病（T2DM）大鼠心肌多不饱和脂肪酸脂肪酸构成的改变并寻找引起改变的原因。方法：1提取T2DM和对照组大鼠血清和心肌总游离脂肪酸，甲酯化后，毛细管气相色谱法测定血清和心肌脂肪酸构成的改变。2分光光度法测定心肌总脂肪酸β氧化活性。3鲁米诺化学发光法测定过氧化物酶体脂肪酸β氧化活性。4用spearman correlation test对多不饱和脂肪酸含量和过氧化物酶体β氧化活性进行相关性分析。结果：12型糖尿病大鼠血清和心肌脂肪酸构成发生改变T2DM大鼠血清中n-6系多不饱和脂肪酸C22:4n-6明显增高（P<0.01），是对照组的7.14倍；n-3系多不饱和脂肪酸LNA和EPA与对照组相比分别下降了62%和19%（P<0.01）；T2DM大鼠n-6/n-3比率（7.9）与对照组（7.1）相比，变化不明显。T2DM大鼠心肌中n-6系多不饱和脂肪酸C18:2n-6增高，是对照组的1.17倍（P<0.01），C22:4n-6明显增高，是对照组的2.57倍（P<0.01）；本研究中观察的所有4种（LNA、EPA、DPA和DHA）n-3系多不饱和脂肪酸与对照组相比分别下降了45%、100%、42%和48%（P<0.01）；由于n-6PUFAs总量的部分上升和n-3PUFAs总量的显著下降，T2DM心肌n-6/n-3比率（8.4）较对照组（3.9）提高了115%。22型糖尿病大鼠心肌过氧化物酶体脂肪酸β氧化活性增加T2DM心肌总脂肪酸β氧化活性（3.02±0.61mU/mg prot, P<0.01）较对照组（1.71±0.33mU/mg prot）提高了76%。T2DM心肌过氧化物酶体β氧化活性（39.2±5.5mU/mg prot, P<0.01）较对照组（30.1±3.6mU/mg prot）提高了约30%。32型糖尿病大鼠心肌EPA、DPA和DHA含量与过氧化物酶体β氧化活性呈负相关T2DM大鼠心肌过氧化物酶体β氧化活性与EPA（r=-0.67, P<0.0001）,DPA（r=-0.63, P<0.0001）和DHA（r=-0.83, P<0.0001）含量呈明显负相关。小结：2型糖尿病大鼠心肌n-3PUFAs（尤其是DHA和EPA）含量明显下降，n-6/n-3比率倍增。2型糖尿病大鼠心肌n-3PUFAs的下降是由过氧化物酶体β氧化活性增加导致。第二部分DHA对2型糖尿病大鼠心肌的保护作用目的：分别从心肌功能，心肌超微结构以及基因表达的差异，评价饮食补充DHA对2型糖尿病（T2DM）心肌的疗效，寻找DHA对2型糖尿病心肌的保护靶点。方法：1用高脂饮食加小剂量STZ的方法复制2型糖尿病大鼠模型，并在其饮食中补充DHA。2利用毛细管气相色谱测定心肌游离脂肪酸水平，观察饮食补充DHA能否逆转T2DM心肌中DHA的下降。3利用高分辨率小动物超声测定左心室重量、收缩期左心室容积、舒张期左心室容积、左心室射血分数和左心室短轴缩短率，评价DHA能否改善T2DM心功能。4利用透射电子显微镜观察心肌的超微结构，确定DHA能否改善T2DM心肌细胞的超微结构。5利用鬼笔环肽染色激光共聚焦观察肌原纤维结，确定DHA能否改善T2DM心肌肌原纤维结构。6利用大鼠基因组mRNA表达谱芯片检测心肌的基因表达水平，筛选T2DM心肌差异表达基因，观察DHA影响了T2DM心肌哪些基因的表达。结果：1饮食补充DHA增加2型糖尿病大鼠体重，但不改变其血糖水平1.1体重在总计32周的干预结束时，DM组大鼠体重（427±48g）明显低于对照组（541±54g）（P<0.01）；而补充DHA的DM+DHA组的大鼠体重（520±56g）明显高于DM组（P<0.01），与对照组相比无差异（P>0.05）。1.2血糖在总计32周的干预结束时，DM+DHA（12.8±4.9mmol/L）组和DM组（15.6±4.4mmol/L）大鼠血糖均明显高于正常对照组（3.99±0.79mmol/L）（P<0.01）；DM+DHA组大鼠血糖与DM组相比，无明显改变（P>0.05）。2饮食补充DHA增加2型糖尿病大鼠心肌DHA含量补充DHA的T2DM大鼠心肌DHA含量（1373±51μmol/g prot）较DM组（335±35μmol/g prot）约高4倍（P<0.01），较对照组（688±27μmol/g prot）约高2倍（P<0.01）。3饮食补充DHA改善2型糖尿病大鼠心功能3.1左心室肥大参数DM组大鼠左心室重量（1135±209mg）较对照组（978±178mg）增加（P<0.01），而DM+DHA组左心室重量（1034±132mg）与其它两组相比均无差异（P>0.05）。左心室重量/体重指数与单纯的左心室重量相比，排除了体重的干扰，能够更加客观的评价心室肥大与否。由于DM组大鼠体重较轻，因此，DM组大鼠（2.66±0.38）左心室重量/体重指数明显高于对照组（1.99±0.24）和DM+DHA组（2.05±0.27）。表明，T2DM大鼠左心室发生肥大，而补充DHA可以防止T2DM大鼠出现左心室肥大。3.2左心室泵血功能和收缩功能的参数DM组（169.8±38.9μl）大鼠收缩期左心室容积明显高于对照组（128.2±17.1μl）（P<0.01）；DM组大鼠左心室射血分数（61.7±3.7%）和左心室短轴缩短分数（34.8±2.6%）均低于对照组（分别是70.0±2.4%和41.4±2.0%）（P<0.01）；而DM+DHA组大鼠与DM组相比，上述三种参数（分别是144.4±19.6μl；68.1±2.4%和40.7±1.4%）均得到明显改善（P<0.01），且与对照组相比无差异（P>0.05）；舒张期左心室容积三组之间无差异（P>0.05）。表明，T2DM大鼠左心室心肌收缩功能已明显下降，而补充DHA可以防止T2DM大鼠心肌收缩功能的下降。4饮食补充DHA改善2型糖尿病大鼠左心室心肌细胞超微结构对照组大鼠心肌细胞线粒体排列整齐，内、外膜和嵴完整，基质密度适中；肌原纤维清晰规整，肌原纤维节（即肌小节）长度适中；Z线、M线清晰可见、排列整齐。DM组心肌细胞线粒体大小不一，排列紊乱，基质密度深；肌原纤维增粗，排列紊乱，并出现大量肌原纤维断裂和溶解现象，肌原纤维节结构紊乱、长度增加；Z线、M线模糊不清，排列不规则。DM+DHA组心肌细胞可见线粒体大小不一，散在排列，基质密度深；肌原纤维节长度增加，其它结构和CON组相比无明显改变。表明，T2DM大鼠心肌肌原纤维断裂和溶解严重，引起其心功能下降；而补充DHA的T2DM大鼠心肌则无此现象，所以心功能基本正常。5饮食补充DHA改善了2型糖尿病大鼠心肌肌原纤维结构CON组肌原纤维纹理清晰，纤维束排列整齐有序；DM组肌原纤维纹理模糊，纤维束排列不规则，可见多处纤维发生断裂和溶解现象；DM+DHA组肌原纤维纹理清晰无断裂，纤维束排列整齐但略有增粗。表明，补充DHA阻止了T2DM大鼠心肌肌原纤维的断裂和溶解，使左心室收缩功能能够基本保持正常。6饮食补充DHA改变了2型糖尿病大鼠心肌mRNA表达谱6.1DM组与CON组之间差异表达基因最多（109个基因上调，224个基因下调）；其次是DM组与DM+DHA组（90个基因上调，135个基因下调）；而DM+DHA组与CON组之间差异表达基因最少（73个基因上调，84个基因下调）。进一步分析发现，DM组和DM+DHA组与CON组相比，拥有相同的64个差异基因（23个上调的基因和41个下调的基因），说明补充DHA没有影响这64个基因的表达；DM组与DM+DHA组和CON组相比，拥有相同的113个差异基因（34个上调的基因和79个下调的基因），说明补充DHA可以将T2DM心肌113个基因恢复至正常表达水平。6.2差异基因的GO分析结果如下：6.2.1GO分析的Cellular Component分析显示，差异基因共涉及了19种细胞元件，其中具有代表性的细胞元件包括：核糖体，胞外区域，ATP合酶复合体，线粒体基质，细胞核和核小体。6.2.2GO分析的Molecular Function分析显示，差异基因共涉及了29种分子功能。其中具有代表性的分子功能包括：核糖体结构组份，翻译起始因子活性，电子载体活性，氢离子转运蛋白活性，ATP和ATPase结合，GTP结合和GTPase活性，短支链脂酰辅酶A脱氢酶活性，果糖二磷酸酶活性，NAD结合，丙酮酸脱氢酶激酶活性，氧化还原酶活性，磷酸肌醇3-激酶活性，SH2域结合活性。6.2.3GO分析的Biological Process分析显示，差异基因共涉及了28个生物过程。其中具有代表性的生物过程包括：蛋白质生物合成，翻译延长，翻译起始，ATP合成偶联质子转运，正向调控慢性炎症反应，细胞应答活性氧簇，细胞凋亡和细胞色素C激活Caspase，内涵体向溶酶体转运，糖代谢，线粒体电子转运，脂蛋白脂肪酶负性调控。6.3差异基因的Pathway分析显示，差异基因共涉及了14条途径。其中具有代表性的Pathway包括：1型糖尿病，P53信号途径，凋亡途径，氧化磷酸化，核糖体，糖酵解/糖异生，紧密连接，蛋白酶体和细胞骨架调节。小结：饮食补充DHA可以逆转T2DM心肌DHA的下降，改善心功能。T2DM心功能的下降与心肌肌原纤维节结构紊乱，大量肌原纤维断裂和溶解有关。DHA可以阻止T2DM心肌发生肌原纤维节结构紊乱，肌原纤维断裂和溶解，从而改善T2DM心功能。DHA可以通过改变T2DM心肌CellularComponent、Molecular Function、Biological Process和Pathway相关基因mRNA的表达，发挥其心脏保护作用。第三部分DHA防止2型糖尿病大鼠心肌肌原纤维断裂和溶解的作用及机制研究目的：探讨2型糖尿病（T2DM）大鼠心肌肌原纤维节结构紊乱，心肌肌原纤维断裂和溶解的原因，以及DHA阻止T2DM发生上述病理改变的分子机制。方法：1Western检测心肌TNNC1，TNNT2和TNNI3三种肌钙蛋白的蛋白含量。2Real time PCR检测心肌TNNC1，TNNT2和TNNI3mRNA的含量。3AMC方法检测心肌总Calpain活性。4Western检测心肌心肌Calpain1、2和4蛋白水平的变化。5Real time PCR检测Calpain1、2和4mRNA的含量的变化。6MTT筛选合适的C16:0浓度，使H9C2心肌细胞的损伤类似糖尿病心肌细胞。7Western和Real time PCR检测DHA干预是否能够抑制C16:0引起的H9C2细胞Calpain降解肌钙蛋白的现象。8流式细胞术观察DHA能否逆转C16:0引起的凋亡。9Hoechst33258染色激光共聚焦观察DHA和C16:0引起的H9C2心肌细胞凋亡形态学变化。10Western和Real time PCR检测DHA能否抑制Caspase3和Caspase12蛋白和mRNA的增加。结果：整体水平结果12型糖尿病大鼠心肌肌原纤维节的肌钙蛋白复合体各蛋白含量明显下降，补充DHA的T2DM大鼠则正常1.1T2DM大鼠心肌肌原纤维节的肌钙蛋白复合体各蛋白含量明显下降Western结果显示，DM组大鼠心肌TNNC1，TNNT2和TNNI3三种肌钙蛋白的蛋白含量明显低于对照组；免疫组化结果同样显示DM组心肌TNNT2与对照组相比明显减少；Real time PCR结果显示，DM组大鼠心肌TNNC1，TNNT2和TNNI3三种肌钙蛋白的mRNA表达分别是对照组的1.23，1.04和1.15倍，基本正常（P>0.05）。表明，T2DM大鼠心肌肌原纤维断裂和溶解与TNNC1，TNNT2和TNNI3蛋白含量下降有关；并且，TNNC1，TNNT2和TNNI3蛋白的减少不是由于表达降低所致。1.2补充DHA的T2DM大鼠心肌，肌原纤维节的肌钙蛋白复合体各蛋白含量正常Western结果显示，DM+DHA组大鼠心肌TNNC1，TNNT2和TNNI3三种肌钙蛋白的蛋白含量明显高于DM组，和对照组基本一致；免疫组化结果同样显示DM+DHA组心肌TNNT2含量明显高于DM组，和对照组基本一致；Real time PCR结果显示，DM+DHA组大鼠心肌TNNC1，TNNT2和TNNI3三种肌钙蛋白的mRNA表达分别是对照组的1.16，0.96和1.18倍，基本正常（P>0.05）。表明，补充DHA阻止T2DM大鼠肌原纤维断裂和溶解的作用，与其能够阻止T2DM大鼠心肌TNNC1，TNNT2和TNNI3蛋白的下降有关；并且，DHA不是通过提高TNNC1，TNNT2和TNNI3的转录水平来阻止它们蛋白下降的。22型糖尿病大鼠心肌Calpain活性明显增加；补充DHA的T2DM大鼠则正常2.1T2DM大鼠心肌Calpain活性明显增加DM组（9.09±2.46ng AMC/hour· μg prot）大鼠心肌Calpain自然活性（Natural）明显高于对照组（4.37±0.75ngAMC/hour· μg prot）（P<0.01）；DM组（17.38±3.96ng AMC/hour· μg prot）大鼠心肌Calpain最大活性（CaCl2）同样明显高于对照组（10.29±1.78ng AMC/hour· μg prot）（P<0.01）。表明，T2DM大鼠心肌肌原纤维节的肌钙蛋白降解与Calpain活性增加有关。2.2补充DHA的T2DM大鼠心肌Calpain活性正常DM+DHA组（4.95±0.88ng AMC/hour· μg prot）大鼠心肌Calpain自然活性（Natural）明显低于DM组（P<0.01），与对照组相比无差异；DM+DHA组（11.01±2.1ngAMC/hour· μg prot）大鼠心肌Calpain最大活性（CaCl2）同样明显低于DM组（P<0.01），与对照组相比无差异；表明，补充DHA阻止T2DM大鼠心肌肌原纤维节的肌钙蛋白降解与其抑制T2DM心肌Calpain活性增加的作用有关。32型糖尿病大鼠心肌Calpain表达增加；补充DHA的T2DM大鼠则不增加心肌表达的Calpain主要为μ-Calpain和m-Calpain，μ-Calpain由1和4两个亚基组成，m-Calpain由2和4两个亚基组成。3.1T2DM大鼠心肌Calpain表达明显增加Western结果显示，DM组大鼠心肌Calpain1、2和4的蛋白表达明显高于对照组；Real time PCR结果显示，DM组大鼠心肌Calpain1、2和4mRNA表达均明显高于对照组（P<0.01），是对照组的2.75，2.45和1.65倍。表明，T2DM大鼠心肌Calpain活性增加与Calpain的表达增加有关。3.2补充DHA的T2DM大鼠心肌Calpain表达正常Western结果显示，DM+DHA组大鼠心肌Calpain1、2和4的蛋白表达明显低于DM组，与对照组基本一致；Real time PCR结果显示，DM+DHA组大鼠心肌Calpain1、2和4mRNA表达均明显低于DM组（P<0.01）；Calpain1、2mRNA表达水平是对照组的0.79和0.66倍（P>0.05），基本正常，Calpain4mRNA表达水平明显低于对照组（P<0.01），是对照组的0.52倍。表明，补充DHA抑制T2DM心肌Calpain的活性与其阻止Calpain表达增加有关。细胞水平结果4通过MTT实验选择C16:0处理H9C2心肌细胞的条件H9C2细胞经不同浓度（50、100、150、200、250、300、400、500μmol/L）的C16:0处理24小时后，H9C2细胞在100~500μmol/L浓度范围内存活率均明显低于溶剂对照组（P<0.01），浓度越高存活率越低。因此，我们选择浓度梯度依赖性最好的C16:0浓度为100、150、200和250μmol/L进行后续实验。5C16:0能够模拟整体水平Calpain降解肌钙蛋白的现象Western结果显示，浓度为100、150、200和250μmol/L的C16:0处理H9C2心肌细胞24小时后，可以发现Calpain1、2和4的蛋白表达呈浓度依赖性增加；相反，TNNC1，TNNT2和TNNI3蛋白则逐渐减少；蛋白条带灰度值进行的spearman correlation test相关分析显示，Calpain和肌钙蛋白含量呈明显负相关（r=-0.71, P<0.0001）。表明，在本实验条件下，成功的利用C16:0处理H9C2心肌细胞模拟了整体水平T2DM心肌Calpain降解肌钙蛋白的现象。因此，我们选择“C16:0浓度200μmol/L处理H9C2心肌细胞24小时”作为后续实验的细胞模型。6DHA可通过下调模型细胞Calpain的表达而阻止肌钙蛋白量的减少Western结果显示，给予12.5、50、100μmol/L DHA均可以明显抑制模型细胞H9C2心肌细胞Calpain1，2和4蛋白的增加，以及TNNC1，TNNT2和TNNI3蛋白的减少；并且Real time PCR检测结果显示,给予12.5、25、50、100μmol/L DHA均可以明显逆转24小时C16:0200μMol处理组H9C2心肌细胞Calpain1，2和4mRNA表达的增加（P<0.01）。表明，DHA确实可通过阻止T2DM心肌上调Calpain表达，降低Calpain的催化活性，减少肌钙蛋白复合体蛋白的降解。7DHA阻止模型细胞的凋亡7.1DHA可以阻止模型细胞H9C2的凋亡12.5、25、50、100μmol/L DHA可以明显减少模型细胞的凋亡率（由21.6%分别降为15.2%、14.2%、12.5%和7.9%）（P<0.01）。MTT结果同样显示，12.5、25、50、100μmol/L DHA可以显著增加C16:0200μMol处理组引起的细胞生存率的下降（P<0.01）。Hochest33258染色结果显示，DHA50μMol可以明显减少模型细胞的凋亡率（细胞核着色较深以及多个细胞核呈碎块状致密浓染的凋亡细胞明显减少）。7.2DHA阻止了Caspase12的表达和Caspase3的激活Western结果显示，给予12.5、50、100μmol/L DHA均可以明显阻止模型细胞H9C2的Caspase12和活性Caspase3蛋白量的增加。Real time PCR结果显示，模型细胞的Caspase3的mRNA表达没有变化（P>0.05），DHA对其表达也没有影响（P>0.05）；但是，12.5、25、50、100μmol/L不同浓度的DHA却可以明显阻止模型细胞Caspase12mRNA的升高（模型细胞是溶剂对照组的4.05倍，加入不同浓度DHA后，分别变为1.76，1.43，1.18和1.30倍）（P<0.01）。Caspase12是Calpain的靶基因，Caspase12的下调不仅使由它激活的Caspase3的量减少，导致细胞凋亡减少，更反映了DHA通过下调Calpain基因的表达，而影响了Calpain的功能。小结：T2DM大鼠心肌肌原纤维节结构紊乱，肌原纤维断裂和溶解与μ-Calpain和m-Calpain各亚基表达增加，引起活性增加，导致肌钙蛋白复合体各蛋白降解有关。DHA防止肌钙蛋白降解，保护T2DM心肌肌原纤维和肌原纤维节结构与其抑制μ-Calpain和m-Calpain各亚基转录水平的增加，进而防止Calpain活性增加有关。DHA可以通过抑制Calpain的表达，进而阻止Caspase12的表达和Caspase3的激活，发挥抗心肌细胞凋亡的作用。结论：1T2DM大鼠心肌过氧化物酶体β氧化活性增加导致n-3PUFA（s尤其是DHA和EPA）含量明显下降，n-6/n-3比率倍增。2饮食补充DHA可以阻止T2DM心肌DHA的下降，保护肌原纤维和肌原纤维节结构，改善心功能。3T2DM大鼠心肌μ-Calpain（1和4）和m-Calpain（2和4）各亚基表达增加，引起活性增加，导致肌钙蛋白复合体各蛋白降解增加，是造成T2DM心肌肌原纤维节结构紊乱，肌原纤维断裂和溶解的原因之一。4DHA可以有效的抑制T2DM μ-Calpain（1和4）和m-Calpain（2和4）各亚基转录水平的增加，防止其活性的增加引起的肌钙蛋白降解，保护了心肌肌原纤维和肌原纤维节结构。