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冠心病发病率、死亡率高,严重危害人类身体健康,被称作是“人类的第一杀手”, 是当今引起死亡的主要原因之一。其中心肌缺血可引起心脏收缩功能的改变,严重者危及病人生命,但经及时治疗可对病人的恢复和愈后起重要作用。冠状动脉病变程度和狭窄程度不同,可以造成不同的后果。冠状动脉狭窄或闭塞血管的再开放导致心肌长期低灌注使心肌细胞代谢处于低水平,导致左室功能逐渐降低,但心肌结构无变化,此时心肌为冬眠心肌,临床上主要表现为节段性低灌注、无收缩或收缩功能低下,血运重建后心肌灌注或室壁运动可完全或部分恢复正常。冠状动脉急性完全闭塞后引起急性缺血的刺激,造成左室功能急剧降低的心肌,称为顿抑心肌,发生结构、功能及代谢的改变,恢复较慢。另一种心肌缺血的后果是心肌坏死(梗塞或瘢痕),是真正的不可逆损伤,即使血运重建,心脏功能也不会得到有效改善,而为瘢痕组织所代替。冠状动脉旁路移植术(percutaneous transluminal coronary angioplasty ,PTCA)为治疗冠状动脉狭窄最常用的手段,PTCA的筛选很重要,选择冬眠心肌和顿抑心肌接受治疗效果才好。因此评价心肌活力引起临床上的重视。评价心肌的活力的方法有多种,18F-FDG PET是金标准,可是18F-FDG PET不能在多数医院普及。符合线路具有部分PET功能,评价心肌活力时能否起到和PET一样的效果呢?本课题主要研究葡萄糖在心肌细胞中的吸收、转运和代谢,利用动物模型进行符合线路葡萄糖代谢显像的基础工作,和临床病人的符合线路检测,以期使符合线路在临床上能得到更好的应用,并为临床研究提供理论依据。 第一部分 心肌细胞摄取18F-FDG的初步研究目的在于观察心肌细胞在体外培养时摄取18F-FDG的变化,并初步研究调节心肌细胞摄取18F-FDG的机制。取出新生乳鼠(1～3天)心脏,在无菌无Ca2+、Mg2+ Hanks液中用眼科剪剪成1mm3的小块组织。在恒温磁性搅拌仪上用0.1%胰蛋白酶37℃消化五次,每次15分钟,收集上清液,1200rpm 离心5分钟,弃去上清留沉淀,加入适量培养液,吹打成细胞悬液备用。待细胞全部收集完全后,放入大口培养瓶中培养1小时,采用细胞贴壁分离技术除去成纤维细胞。进行细<WP=6>胞计数,每孔细胞密度在1×106/ ml左右,放入37℃ 5% CO2培养箱培养,24h换液。将细胞分成低葡萄糖组、低葡萄糖胰岛素组(1mg/L)、高葡萄糖组(4.5g/L)、高葡萄糖胰岛素组4组。分组培养3天后加入7.4MBq/ml 18F-FDG 100μl,轻微混匀后放入37℃培养箱中,分别在10min、20min、30min、40min、50min、60min弃去培养液,清洗5次,消化收集细胞用γ放射免疫计数器测定计数,绘制摄取曲线。结果发现心肌细胞摄取18F-FDG在50min达高峰。将细胞集中,用RIPA裂解法析出蛋白成分。采用Bio-rad DC Protein Asssay试剂盒测定其蛋白质浓度,按总量50μg的量加入到12%SDS聚丙烯酰胺凝胶,并用β-acting作为对照进行电泳,转PVDF膜、封闭,用rabbit anti-mouse GLUT4一抗室温孵育,二抗peroxidase- labeled affinity goat anti-rabbit (H+L)室温孵育,用ECL KIT观察荧光压片、定影、冲出胶片。结果发现在高葡萄糖胰岛素组GLUT4出现最多,低葡萄糖组GLUT4出现较少,而高浓度葡萄糖组较低浓度葡萄糖组含量增多。说明高浓度葡萄糖可促进GLUT4的增加,促进18F-FDG摄取,胰岛素可促进GLUT4的增加,促进18F-FDG的摄取。第二部分 小型猪心肌缺血模型的制作与鉴定目的是制作小型猪心肌梗死和缺血模型,并建立活体判断模型建成与否的方法。并观察GLUT1、GLUT4在正常及异常心肌细胞的分布。12只雌性巴马小型猪,体重15～20Kg,空腹6h以上,以氯氨酮、地西泮、阿托品肌肉注射行基础麻醉,氯氨酮、利多卡因维持麻醉。在左侧3,4肋间行皮肤切开,固定心包,找到左心耳,分离回旋支动脉,留置7号丝线备用,首先进行心肌缺血的预适应,第一组动物在回旋支的远端分支分出后结扎回旋支,制作梗死模型。第二组动物在回旋支近端放置ameroid缩窄环(2.5mm～3.0mm)制作心肌缺血模型。冠状动脉处理完毕后缝合心包;逐层缝合肌肉;用青霉素粉剂防止感染,并进行肺部排气;缝合外部皮肤。梗死组10天,缺血组30天后行静息和多巴酚丁胺负荷心肌灌注显像,实验结束后处死动物,并对心脏进行TTC染色,根据染色与否定义其梗死灶或缺血灶;HE染色,确定心肌病理学的变化,免疫组化染色,观察GLUT1和GLUT4在两种不同心肌的变化。通过结扎回旋支和ameroid环缩窄回旋支制备小型猪心肌梗死和缺血模型,能够成功建立小型猪心肌梗死和缺血的动物模型,99mTc-MIBI心肌血流灌注显像可在活体上显示小型猪模型心肌梗死灶的放射性缺损区和缺血灶灌注缺损区的放射性再充填。离体心肌TTC染色可显示相应的梗死或缺血灶。<WP=7>第三部分 符合线路18F-FDG心肌显像诊断 梗死心肌活力的实验研究 通过对小型猪进行开胸手术制备动物模型,进行心肌血流灌注显像与符合线路葡萄糖代谢显像判断心肌活力并通过病理检查做出对照。6只巴马雌性小型猪,体重16～22Kg,用结扎回旋支的方法形成心肌梗死模型,术前自身对照形成对照组。造模成功后10天进行心肌血流灌注显像。 小型猪空腹至少12h,氯氨酮、地西泮基础麻醉,氯氨酮、利多卡因维持麻醉。首先进行血流灌注显像:采