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丙型肝炎病毒(HCV,hepatitis C virus)感染可影响宿主细胞信号的传导、改变细胞基因的表达,宿主基因表达的变化可能影响病毒的感染或参与病毒的致病。本课题通过表达谱基因芯片分析,找出了一个在HCV感染后表达上调的细胞分子:硫氧还蛋白互作蛋白(TXNIP,thioredoxin-interactingprotein),并发现敲低Huh7细胞中TXNIP的表达会抑制J6/JFH1株HCVcc的感染。进一步对TXNIP进行深入研究,验证其差异表达,探讨其对HCV感染的影响:1、HCV通过什么机制诱导TXNIP上调;2、TXNP在HCV的生命周期中发挥什么作用;3、HCV感染诱导的TXNIP上调是否参与到HCV的致病过程。希望通过研究,揭示宿主分子TXNIP与HCV相互作用的分子机制,探讨TXNIP分子对HCV感染与致病的影响。本文主要结果及结论如下:(一)HCV感染诱导Huh7细胞系表达谱变化,宿主分子TXNIP转录水平上调利用MOI=1的HCVcc感染Huh7细胞,感染72 h以后用抽提感染细胞以及对照组细胞的总RNA,样品送生物技术技术公司进行Glue Grant Human Transcriptome Array基因芯片分析,比较HCVcc感染前后的Huh7细胞转录组差异。发现了871个显著上调基因(上调≥1.5倍),765个下调基因(下调≤0.66倍);2339个上调显著的非编码RNA,2479个下调显著的非编码RNA;27条变化显著的miRNA,以及210个可变剪切方式变化显著的基因。可以看出,在Huh7细胞系感染HCVcc以后,宿主分子TXNIP的mRNA上调约3.7倍。采用RT-PCR法,对感染HCVcc和对照组的Huh7细胞中TXNIP的mRNA转录情况进行验证,再一次确定了在HCVcc感染的Huh7细胞中TXNIP转录水平显著上调。为进一步研究HCVcc感染后基因表达谱变化,对用MOI=1的HCVcc感染12 h,36 h,60 h的Huh7细胞系的基因转录组进行转录组深度测序,并将其与各时间点的对照样品进行对比,结果表明:TXNIP的mRNA在HCVcc感染后36 h,60 h均有明显上调,以36 h上调最为显著。(二)干扰TXNIP表达会使HCV复制受到影响合成针对TXNIP的siRNA,转染Huh7或Huh7.5.1细胞以敲低TXNIP的表达。感染MOI=0.2的HCVcc,48 h后免疫荧光检测HCVcc的感染。结果显示,TXNIP敲低的细胞与转染非特异结合的siRNA阴性对照组以及未转染siRNA的空白对照组相比,HCVcc的感染量显著降低。将构建好的TXNIP真核表达载体转染到Huh7和Huh7.5.1细胞中,阴性对照为转染GFP真核表达载体的细胞,空白对照的细胞不进行任何处理。随后感染MOI=0.2的HCVcc,48 h后免疫荧光检测HCVcc的感染。结果显示,TXNIP过表达的细胞与转染GFP表达质粒的阴性对照以及未转染质粒的空白对照细胞相比,HCVcc的感染有所提高。为检测宿主分子TXNIP对HCV入侵的影响,将siRNA转染至Huh7.5.1细胞系中降低TXNIP表达,阴性对照为转染非特异结合的siRNA,空白对照不做处理,分别感染HCV入侵模型:con1型的HCVpp。培养72 h后直接在荧光显微镜下观察带有绿色荧光标记的HCVpp感染细胞,并计数。结果显示,敲低TXNIP的表达不影响HCVpp的入侵。为检测宿主分子TXNIP对HCV复制的影响。在1b基因型HCV亚基因组复制子BB7细胞系中转染siRNA干扰TXNIP的表达,对照组转染非特异结合的siRNA。转染72 h后抽提BB7细胞系中RNA,采用RT-PCR检测J6/JFH1型HCV非结构基因的含量。结果显示降低宿主分子TXNIP的表达,HCV的复制水平随之明显降低。综上所述,宿主细胞中的TXNIP对HCV的感染有促进作用。这种促进作用可能作用于HCV复制阶段。(三)HCV感染不会诱导Huh7.5.1细胞系中TXNIP上调为验证HCVcc感染诱导TXNIP上调的情况是否在其它可以感染HCV的细胞系中成立,在Huh7和Huh7.5.1中进行了更细致的研究。其中Huh7.5.1和Huh7相比,RIG-1基因发生突变,因此在病毒RNA诱导的IFN合成方面具有缺陷。用MOI=0.5的HCVcc感染Huh7和Huh7.5.1细胞,分别取感染12 h、以及1-4天的样本以及相应的对照样本,用RT-PCR检测TXNIP mRNA的变化情况。结果显示,在Huh7细胞中,HCVcc感染1天以后即可以检测到TXNIP在mRNA水平和蛋白水平上的上调。而在Huh7.5.1细胞中,HCVcc感染并没有使TXNIP的mRNA和蛋白表达量有所提高。(四)干扰素诱导Huh7和Huh7.5.1细胞系中TXNIP上调分别合成IFN-α、IFN-β以及IFN-λ的真核表达质粒,转染293T细胞,收取细胞上清以及未经转染的细胞培养上清(对照)。用不同浓度的干扰素上清处理HCVcc感染的Huh7.5.1细胞,2天后免疫荧光检测病毒的感染水平。用50%抑制HCV感染的干扰素浓度处理Huh7和Huh7.5.1细胞。12 h、1-3天后检测细胞内的TXNIP mRNA。结果显示,三种干扰素处理12 h后即可观察到TXNIP mRNA水平明显上调,之后干扰素水平持续上调,在2d的时间达到顶峰。