课题一脑外伤后蓝斑和肾上腺髓质酪氨酸羟化酶的表达及其调控机制目的:观察机械性脑外伤蓝斑（LC）、肾上腺髓质中儿茶酚胺合成的限速酶-酪氨酸羟化酶（TH）及其转录因子c-fos、激活蛋白2α（AP-2α）的表达变化,以探讨脑外伤应激对TH表达及其调控机制的影响。方法:1、成年Wistar大鼠105只,随机分为对照组和实验组,实验组采用Feeney法制作机械性脑外伤模型,分别在伤后1h、3h、6h、24h、48h和72h六个时间点取材;2、机械性脑外伤后,在各个时段观察大鼠的行为学变化,并进行行为学评分;3、运用HE染色、尼氏染色等方法,观察模型鼠LC、肾上腺髓质的形态学改变;4、用免疫组化、免疫荧光双标,检测机械性脑外伤模型大鼠LC、肾上腺髓质TH和c-fos、AP-2α的表达变化;5、用免疫印迹和RT-PCR检测TH、c-fos和AP-2α的mRNA在LC、肾上腺髓质的表达变化;6、计算机图像分析等方法,测量相关的免疫组化染色强度的变化及阳性神经元数量的变化用荧光显微镜和共聚焦显微镜分别对荧光光标记的阳性细胞数量和荧光强度进行检测;7、利用SPSS统计软件对实验结果进行统计分析。结果:1、大鼠行为学和形态学变化:机械性脑外伤后大鼠出现了明显的行为学改变,其行为学评分比对照组明显降低。HE染色显示,脑外伤后大鼠LC、肾上腺髓质无明显的形态学改变;尼氏染色显示,LC神经元内尼氏体染色增强、数量增多。2、蓝斑TH/AP-2α的表达变化:免疫荧光显示:外伤组各时段LC中TH和AP-2α阳性细胞数量和荧光强度比正常组显著增加（P<0.05）。两者的表达变化是一致的,从伤后1小时就已经升高,至3小时达到高峰,72小时仍然高于对照组。TH和AP-2α的表达范围基本一致,绝大部分TH阳性的细胞都表达AP-2α。3、蓝斑TH/c-fos的表达变化:免疫荧光显示,外伤组各时段LC中TH阳性细胞数量和荧光强度都显著增加,在脑外伤后1小时已经增强,3小时达到高峰,72小时逐渐降低,但仍高于对照组（P<0.05）;LC内c-fos阳性细胞数量和荧光强度在伤后1小时增加,3小时达到高峰,但24小时后回到基线水平,TH和c-fos的表达范围基本重叠,多数TH阳性的细胞都表达c-fos。4、TH/AP-2α和TH/c-fos在肾上腺髓质的表达变化:免疫荧光显示,外伤组各时段肾上腺髓质TH阳性细胞数和荧光强度都有显著增强（P<0.05）,在脑外伤后1小时开始增强,3小时达到高峰,72小时染色强度逐渐降低,但高于对照组;AP-2α在肾上腺髓质中的变化与TH相一致;c-fos阳性细胞数和荧光强度在伤后1小时已经增强,3小时达到高峰,但到24小时就回到基线水平,TH、c-fos和AP-2α的表达范围基本相互重叠,肾上腺髓质中多数TH阳性细胞均表达c-fos和AP-2α。5、免疫印迹实验和PCR证实了上述TH、AP-2α和c-fos在外伤后不同时段的表达变化规律。TH和c-fos在伤后早期（24小时内）的表达变化是相关的,TH与AP-2α的表达在伤后1至72小时都是相关的。结论:1、证实在脑外伤应激后,LC和肾上腺髓质TH在检测各时段均表达增强。提示LC和肾上腺髓质在应激状况下会释放大量儿茶酚胺,作用于相应受体或靶器官,参与对神经系统、心血管和代谢功能的调节,以适应机体应激产生的急性反应;2、c-fos在外伤后早期（24小时内）LC和肾上腺髓质阳性细胞数量和荧光强度均比对照组增加,表达高峰与TH一致,均是在伤后3小时,并在同一细胞能够共表达,而且TH启动子上具有c-fos的作用位点,表明c-fos在外伤后早期（24小时内）参与了LC和肾上腺髓质TH的表达调控;3、在脑外伤应激状态下,在LC和肾上腺髓质AP-2α阳性细胞数量和荧光强度均显著增加,在所检测各时段的变化趋势都与TH表达相一致,AP-2α和TH在细胞中有共表达,而且AP-2α在TH启动子上也有相应的作用位点,提示在脑外伤应激过程中,AP-2α调控了TH的基因转录;4、首次报道转录因子c-fos、AP-2α同时参与了脑外伤应激后LC和肾上腺髓质中TH的基因转录,为进一步研究脑外伤应激的分子机制提供了理论基础。课题二激活的Notch信号通路对嗅鞘细胞增殖及成鞘能力的影响一、激活的Notch信号通路对嗅鞘细胞增殖能力的影响目的:观察激活的Notch信号通路对嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells, OECs）的增殖分化的影响,以探讨Notch信号通路促进OECs增殖的作用机制。方法:1.取新生大鼠嗅球的嗅神经层和嗅小球层的OECs,采用DMEM培养液（含10%胎牛血清）培养7天后,用免疫细胞化学检测GFAP、P75在OECs中的分布及表达;2.将Notch活性质粒(Notch^ICV,c-myc为报告基因)、Notch非活性质粒(Notch^VK,c-myc为报告基因)及对照组（空载体转染）转染到培养7天的OECs,转染试剂为Lipofectamine 2000,3天后观察细胞;3.通过HE染色观察Notch^ICV、Notch^VK转染组及对照组的细胞密度和形态,用免疫细胞化学检测报告基因c-myc在OECs中的表达,判断Notch质粒是否转染成功,并分别对各组的c-myc阳性细胞进行计数;4.通过胶质原纤维酸性蛋白（GFAP,OECs表达的特异性蛋白）和c-myc免疫荧光双标,观察GFAP在Notch^ICV转染组、Notch^VK转染组及对照组的细胞内表达是否有差异,并通过免疫印迹法进行验证。5.固定细胞前12小时,用BrdU标记OECs,用免疫细胞化学检测BrdU在OECs的表达,分别对各组BrdU阳性细胞进行计数;6.用计算机图像分析方法,测量免疫细胞化学的染色强度及阳性细胞数量的变化,用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜分别检测荧光标记的阳性细胞数和荧光强度;7.利用SPSS统计软件对实验结果进行统计分析。结果:1.免疫细胞化学显示,GFAP和P75在绝大多数细胞中都有表达,其阳性产物不仅分布于胞浆,也分布于细胞突起中,表明本实验获得了纯度较高的OECs。HE染色发现OECs呈梭形、纺锤形或三角形,在转染质粒前后细胞形态没有发生明显改变,但Notch^ICV转染组的细胞密度比Notch^VK转染组明显增加（P<0.05）,而Notch^VK转染组与对照组的细胞密度无明显差异;2.免疫细胞化学显示,Notch^ICV和Notch^VK转染组均可见报告基因c-myc的表达,表明Notch质粒已成功转入细胞中;Notch^ICV转染组的c-myc阳性细胞数比Notch^VK转染组显著增加（P<0.05）,而对照组无c-myc阳性细胞出现;3.免疫细胞化学发现,BrdU阳性细胞数在Notch^ICV转染组均明显增加（P<0.05）,Notch^VK转染组及对照组的BrdU阳性细胞数没有差别;4.免疫荧光双标显示,在Notch^ICV和Notch^VK转染组可见c-myc和GFAP在OECs共表达,提示Notch基因已转入OECs内。免疫荧光强度值和免疫印迹法结果均显示Notch^ICV转染的OECs内GFAP的表达明显强于Notch^VK转染组及对照组（P<0.05）,后两者GFAP表达没有差别;结论1. BrdU和c-myc的检测结果表明,Notch基因对OECs的增殖具有明显促进作用。2. Notch基因促进OECs增殖的机制存在两种可能性:一种是,Notch通过启动下游效应物Hes基因的转录,后者对胶质细胞增殖有促进作用,从而促进OECs增殖;另一种是,激活的Notch信号可与OECs特异性GFAP基因的启动子上相应位点结合,调控其转录,GFAP转录增强可通过某种方式诱导OECs增殖。二、激活的Notch信号通路促进OECs成鞘的初步研究目的:观察激活的Notch信号通路对OECs的成鞘能力的影响,以探讨Notch信号通路促进OECs成鞘能力的作用机制。方法:1.神经元的分离、培养和鉴定:取新生鼠大脑皮层的感觉运动皮质,分离并获取其细胞成分;用DMEM培养液（含10%胎牛血清）在培养板上作神经组织细胞培养,在培养的第3天,加入10μmol/L阿糖胞苷,以抑制胶质细胞生长,48小时后去除阿糖胞苷,用含胎牛血清的DMEM培养液继续培养2天后,用免疫细胞化学检测神经元的标记物-神经中间丝（NF）的表达;2. OECs分离、培养、鉴定及质粒转染:OECs的分离、培养、鉴定同第一部分,培养OECs 7天后,用Notch^ICV、Notch^VK及空质粒转染OECs（转染试剂为Lipofectamine 2000）,转染3天后,通过免疫荧光双标和免疫印迹等技术检测神经细胞粘附分子（NCAM）和c-myc在Notch^ICV、Notch^VK共培养组及对照组的OECs内的表达变化;3. Notch基因促进OECs成鞘的初步观察:将转染3天的OECs接种到含有神经元的培养板中,与神经元共培养3天后观察细胞;用免疫细胞化学检测报告基因c-myc在共培养中的表达,以了解Notch基因转染的OECs与神经元之间的相互作用及由此产生的结果（包括细胞行为学和形态学变化等）;4.用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜分别检测荧光标记的阳性细胞数和荧光强度,利用SPSS统计软件对实验结果进行统计分析。结果:1.免疫细胞化学显示,绝大多数培养细胞表达神经中间丝（NF）,NF阳性产物主要分布于神经元的胞浆及其突起,表明加阿糖胞苷后可抑制胶质细胞,从而得到纯度较高的神经元。HE染色显示培养的神经元具有较大的胞体,拥有较长的轴突和细而短的树突;2.免疫荧光双标显示,在Notch^ICV和Notch^VK转染组,可见c-myc和NCAM在OECs中共表达;免疫荧光强度值和免疫印迹法结果均显示Notch^ICV转染的OECs内NCAM的表达明显强于Notch^VK转染组及对照组（P<0.05）,后两者NCAM表达没有差别;3.免疫细胞化学显示,Notch^ICV转染的OECs（报告基因为c-myc）与神经元共培养后,大量的c-myc阳性细胞向着神经纤维聚集并粘附、部分c-myc阳性细胞在纤维表面融合并形成髓鞘,而Notch^VK转染的OECs与神经元共培养后,c-myc阳性细胞散在分布于神经纤维周围。结论1. NCAM的检测结果表明,激活的Notch信号通路可诱导OECs细胞粘附分子NCAM表达增加。2. Notch基因促进OECs体外成鞘,其可能机制有两种:一是,Notch通路可促进OECs增殖,细胞数量增加,有利于更多OECs与神经纤维的接触;另一种是,激活的Notch信号可促进OECs中NCAM分泌,NCAM作为一种粘附分子,可促进OECs在神经纤维上的粘附并形成髓鞘。