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表观遗传研究不改变DNA序列下基因表达的可遗传改变,DNA甲基化是表观遗传学研究的重要内容,催化DNA发生甲基化的酶被称为DNA甲基化酶（DNA methyltransferases,dnmts）。硬骨鱼类特有的第三轮基因组复制增加了DNA甲基化酶家族成员数目,拥有1个维持DNA甲基化酶以及3-5个从头DNA甲基化酶。已有的研究表明在鱼类卵巢和精巢之间DNA甲基化水平存在巨大差异,在鱼类性逆转过程中,包括雌鱼向雄鱼性逆转以及雄鱼向雌鱼性逆转,性别决定和分化关键基因的DNA甲基化水平以及一些DNA甲基化酶家族成员的表达发生显著改变。这些结果暗示DNA甲基化酶在鱼类性别决定和分化过程中可能发挥着重要作用。然而,目前对DNA甲基化酶在鱼类性腺发育过程中的表达和功能鲜有报道。尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）是世界性的养殖鱼类,拥有XX/XY性别决定系统,其性别由遗传和环境因素共同决定。罗非鱼雄性比雌性生长快50%,性别决定和分化机制的解析有利于遗传育种。本研究采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,q RT-PCR）和荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）分析了DNA甲基化酶家族成员在尼罗罗非鱼性腺中的表达模式,采用DNA甲基化酶抑制剂解析了DNA甲基化酶在性腺发育以及性别分化中的功能,构建dnmt3aa和dnmt3ab突变系进一步揭示了其在性腺发育中的作用。主要研究结果如下:1、DNA甲基化酶家族成员在尼罗罗非鱼性腺发育中的表达研究。尼罗罗非鱼DNA甲基化酶家族有6个成员,包括一个维持甲基化酶dnmt1,以及5个从头甲基化酶dnmt3aa、dnmt3ab、dnmt3ba、dnmt3bb.1、dnmt3bb.2。q RT-PCR分析显示DNA甲基化酶家族成员在尼罗罗非鱼性腺不同发育时期（5、30、60、90、120和180 days after hatching,dah）呈性二态性表达,dnmt1和dnmt3ba在卵巢中的表达显著高于精巢,dnmt3aa、dnmt3ab、dnmt3bb.1和dnmt3bb.2在精巢中的表达高于卵巢。荧光原位杂交显示,dnmt1、dnmt3aa、dnmt3ba、dnmt3bb.1、dnmt3bb.2高表达于卵巢卵原细胞、I时相和II时相卵母细胞、颗粒细胞以及精巢精原细胞和精母细胞,dnmt3ab高表达于卵巢颗粒细胞以及精巢精原细胞和精母细胞。2、DNA甲基化酶抑制剂5-aza-d C处理对尼罗罗非鱼性腺发育的影响。（1）采用含有不同浓度梯度5-aza-d C饲料投喂5 dah雌性（XX）和雄性（XY）仔鱼,发现5-aza-d C显著增加罗非鱼畸形率和死亡率,5-aza-d C处理组存活个体体重显著降低。性腺形态学观察和组织学分析表明,与对照组雌鱼相比,处理组雌鱼性腺更加细小、性成熟系数（gonadosomatic index,GSI）显著降低、卵巢出现大量空腔,而处理组雄鱼与对照组雄鱼相比性腺形态以及GSI无显著差异,处理组精巢有大量空腔产生。凋亡检测发现,与对照组相比处理组罗非鱼精巢和卵巢生殖细胞凋亡显著增加。免疫荧光显示,处理组雌鱼卵巢仍表达雌性通路关键基因cyp19a1a,处理组雄鱼精巢仍高表达雄性通路关键基因amh和gsdf,不表达cyp19a1a。这些结果表明,5-aza-d C单独投喂处理雌、雄尼罗罗非鱼均未发生性逆转。（2）采用5-aza-d C和芳香化酶抑制剂（aromatase inhibitor,AI）同时投喂30 dah雌鱼（XX）。性腺组织学检测显示,AI处理组、5-aza-d C和AI同时处理组雌鱼均发生由雌向雄的性逆转且性逆转率无显著差异。在120 dah,两组处理鱼均进行了精子发生。（3）采用5-aza-d C和雌二醇（17β-estradiol,E2）同时投喂30 dah雄鱼（XY）,75 dah时性腺组织学分析显示5-aza-d C和E2同时处理组有少量卵母细胞的产生,免疫组化检测显示5-aza-d C和E2同时处理组性腺既表达雌性通路关键基因cyp19a1a和卵母细胞标记基因42sp50,又表达雄性通路关键基因amh和gsdf。120 dah时统计分析发现,5-aza-d C和E2同时处理组雄鱼性逆转率显著高于E2单独处理组,而性腺cyp19a1a启动子甲基化水平显著低于雄性对照组。3、突变dnmt3aa和dnmt3ab对尼罗罗非鱼性腺发育的影响。为进一步研究DNA甲基化酶家族成员在罗非鱼性腺发育中的功能,采用CRISPR/Cas9对尼罗罗非鱼关键DNA甲基化酶家族成员dnmt3aa和dnmt3ab进行敲除。筛选获得dnmt3aa-/-和dnmt3ab-/-鱼并进行性腺形态学观察和组织学分析,结果表明,在60、120和240 dah,dnmt3aa-/-XX鱼卵巢萎缩退化,GSI显著降低,卵原细胞以及卵母细胞的数量与野生型（wild type,WT）相比显著减少,dnmt3ab-/-卵巢与WT相比无显著差异。在60 dah,dnmt3aa-/-精巢与WT精巢相比GSI以及精原细胞的数量均无显著差异,在120和240 dah,dnmt3aa-/-精巢更加透明,GSI显著降低,精巢中具有大量空腔,精母细胞和精子细胞数量显著减少,而dnmt3ab-/-精巢与WT相比无显著差异。在60 dah,免疫荧光显示dnmt3aa-/-卵巢仍然表达雌性通路关键基因cyp19a1a。此外,在dnmt3aa另外一个靶点F0代高突变率雌鱼卵巢中也观察到生殖细胞显著减少现象。凋亡检测发现,与dnmt3ab-/-和WT卵巢相比,60 dah dnmt3aa-/-卵巢生殖细胞凋亡数量显著增加,与dnmt3ab-/-和WT精巢相比,120 dah dnmt3aa-/-精巢精母细胞凋亡数量显著增加。与此相一致,q RT-PCR分析显示,与WT和dnmt3ab-/-相比60 dah dnmt3aa-/-卵巢中凋亡相关基因baxa、baxb、caspase3a、caspase3b和caspase8的表达显著升高,120 dah dnmt3aa-/-精巢中凋亡相关基因baxa、baxb、caspase3b和caspase8的表达显著升高。同时,在60 dah dnmt3ab-/-卵巢中观察到dnmt3aa表达代偿性的升高,在120 dah dnmt3aa-/-和dnmt3ab-/-精巢分别观察到dnmt3ab和dnmt3aa代偿性升高。对240 dah dnmt3aa-/-、dnmt3ab-/-和WT雄鱼精液进行检测分析发现,与dnmt3ab-/-和WT相比,dnmt3aa-/-精液中精子浓度显著降低,向前运动精子的比例显著减少,不运动精子的比例显著增加,dnmt3aa-/-精子的直线运动、曲线运动以及精子鞭毛拍打频率显著低于WT和dnmt3ab-/-鱼。扫描电镜和巴氏染色结果显示,WT和dnmt3ab-/-精液中精子带有长直的尾巴,而dnmt3aa-/-有部分精子尾巴缩短、卷曲。在120 dah,采用5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine,5-m C）抗体检测性腺发现,dnmt3aa-/-卵巢和精巢整体5-m C水平显著低于dnmt3ab-/-和WT,此外,dnmt3aa-/-卵巢颗粒细胞以及精巢精原细胞、精母细胞和精子细胞5-m C水平显著低于dnmt3ab-/-和WT。这些结果表明,从头DNA甲基化酶dnmt3aa在罗非鱼性腺生殖细胞发育过程中发挥重要作用。综上所述,DNA甲基化酶家族成员在尼罗罗非鱼性腺呈性二态性表达,dnmt1和dnmt3ba在卵巢中的表达显著高于精巢,dnmt3aa、dnmt3ab、dnmt3bb.1和dnmt3bb.2在精巢中的表达高于卵巢。这些基因高表达于卵巢卵母细胞、颗粒细胞以及精巢生精细胞。仅抑制DNA甲基化酶不能导致罗非鱼性逆转,但引起卵巢和精巢生殖细胞凋亡增加。E2和DNA甲基化酶抑制剂同时处理能够显著降低cyp19a1a甲基化水平并提高XY鱼的次发性逆转率。敲除dnmt3aa和dnmt3ab不能导致罗非鱼性逆转,然而dnmt3aa突变体精巢和卵巢生殖细胞凋亡增加,精子质量降低,精巢和卵巢5-m C水平显著降低,敲除dnmt3ab没有明显的性腺表型很可能是由于dnmt3aa的补偿所致。说明dnmt3aa而非dnmt3ab对性腺基因的从头甲基化、性别分化和性腺发育有重要作用。本研究在理论上有助于丰富人们对表观遗传修饰在鱼类性别分化和性腺发育中的认识,在实践上有助于鱼类性控育种。